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日志

 
 

肿瘤基因治疗载体的选择及使用安全性的研究进展  

2012-02-15 23:01:21|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

【摘要】    随着对肿瘤发生发展分子机制认识的不断深入,肿瘤的基因治疗已成为攻克和治愈肿瘤最具希望和挑战的研究领域。如何建立安全有效的治疗基因导人系统成为研究者们首要解决的问题。目前,常用的载体主要有病毒载体和非病毒载体两类:病毒载体的转移效率高,在基础研究和临床试验中应用广泛,但近年来因存在安全性的问题,其使用受到了一定的制约;非病毒载基因导入的效率相对较低,但具有安全性好且容易制备的特点,日益受到人们的重视。现就近年来国内外对于肿瘤基因治疗载体的使用选择及安全性研究作一综述。

【关键词】  肿瘤;基因治疗;载体;安全性

    肿瘤是一类严重危害人类健康的疾病,伴随竞争加剧和环境污染,预计到2020年将有近2000万/年的新发肿瘤病例,死亡人数可达到1200万/年。目前肿瘤的主要治疗手段是手术、放疗和化疗,虽然有一定成效,但是距离彻底根治肿瘤还很遥远,人们将希望寄托于基因治疗。目前,应用于肿瘤基因治疗研究的载体主要分为病毒性载体和非病毒性载体两大类。本文就目前在肿瘤基因治疗方面所应用的基因转运系统各常用载体的使用现状、安全性及其研究进展做一综述。

  1  病毒载体

    病毒能够自然感染细胞,从而可将自身的遗传物质带至宿主细胞。RNA和DNA病毒均可作为基因运载工具,病毒载体具有天然嗜性,使其能有效转导外源基因进入靶细胞。在基因治疗过程中,一方面要有效利用病毒感染细胞效率高的优点;另一方面又必须克服病毒载体的天然嗜性所带来的潜在安全性问题。

  1.1  逆转录病毒载体 

  逆转录病毒(retrovinls,RV)为RNA病毒,该载体即是将结构基因去掉换成外源基因,在体外的包装细胞内组装成含有目的基因的重组逆转录病毒,该重组逆转录病毒不具致病性;在逆转录病毒感染细胞后,整合至细胞染色体上,从而实现其携带外源目的基因的作用;具有转染效率高,靶向性差,体内病毒滴度较低的特点。Barzon等[1]将白细胞介素-2基因和单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因同时插入反转录病毒载体治疗甲状腺癌,可使瘤体比单独利用白细胞介素-2基因进行治疗时缩小3~4倍。但逆转录病毒只能转染处于分裂增殖期的细胞,且与受染细胞的整和具有随机性,故具有潜在的危险性。因担忧其安全性问题,故目前逆转录病毒载体多用于体外转染[2]。现阶段国内外学者们仍在寻求开发新的更为高效安全稳定的逆转录病毒载体,如已报道的复制缺陷型泡沫病毒载体[3]等。

  1.2  腺病毒载体 

  腺病毒(adenoviru,Ad)为双链DNA病毒,它能感染各时相的细胞,以其高效转染和高效表达而成为应用广泛的病毒载体[4]。常树建等[5]构建腺病毒载体介导抗-VEGF发状核酶的实验结果显示:腺病毒可高效感染HT-29 细胞,有效抑制VEGF的表达及移植瘤组织内血管的生成。但腺病毒作为载体也有自身的局限性:(1)表达时间短,容量小(4.5kb),免疫原性强;(2)缺乏理想的动物模型来进行临床前毒性研究;(3)对肝细胞的天然嗜性容易造成腺病毒颗粒在肝脏中积累从而诱发肝脏损伤[6],这些使得腺病毒作为基因治疗的载体具有一定的危险性,从而限制了其在临床上的应用。

  1.3  腺病毒相关病毒载体 

  腺病毒相关病毒(adenovirus-associated virus,AAV)为单链DNA病毒,具有长期稳定整合的特点,且适用于表达生物活性物质的基因,在高滴度情况下也未发现引起炎症反应的副作用,已有逐步取代腺病毒载体之势。齐荣等[7]通过构建特异性杀伤肿瘤细胞的腺相关病毒载体AAV-hTERT-TRAIL的研究结果显示,其可以介导肿瘤细胞特异性基因表达与杀伤作用,同时对正常细胞无毒性。目前,该载体的主要局限是难以大量生产和载体容量有限,但新的复制模型有望解决这些问题。

  1.4  单纯疱疹病毒载体
 
  单纯疱疹病毒(herps simple virus,HSV)为双链DNA病毒,可引起口唇及生殖道黏膜感染,且具有嗜神经性。此类病毒感染神经未梢并导致潜伏感染,这一特性常被用来进行脑部肿瘤的基因治疗,但它所引起的神经毒性及潜伏性感染也不容忽视。研究显示,复制缺陷型载体则不含HSV-I的任何编码基因,细胞毒性及免疫原性小,基本消除了病毒基因表达的可能,使宿主细胞中不存在野生型潜伏感染而安全性好[8] 。

  1.5  痘病毒载体 

  痘病毒(poxvirus,PV)为双链DNA病毒,主要用于制备疫苗。痘病毒载体具有低毒性和高容量的特点,其与单纯疱疹病毒载体是仅有的能够同时携带多个外源基因的转运系统,因而作为体内转基因的载体是个不错的选择,但是在应用于人体时,由于其免疫原性强,限制了其在临床中的应用。近年,国外报道开发了一种新型减毒痘病毒载体NYVAC安全性高,目前已进入I/Ⅱ期临床试验[9]。

  1.6  其它病毒载体 

  此外,慢病毒(lentivirus)、杆状病毒(Baculovirus)、重组仙台病毒(Sendai virus,SV)载体也有报道,但是要进入人体还需要进行大量深入的研究。

  2  非病毒载体

    欧美目前已有大于20%的临床研究应用非病毒载体,其中常用的主要包括:真核细胞表达质粒载体(裸DNA)、阳离子多聚物载体、脂质体、纳米粒、厌氧菌等。
2.1  真核细胞表达质粒载体  真核细胞表达质粒载体主要用于基因治疗的直接体内治疗方案,该方法是将治疗用的目的基因克隆到构建好的真核细胞表达质粒载体中去,采用裸DNA肌肉注射的方法,直接转移到体内,在肌肉组织中表达目的蛋白质,发挥治疗作用。目前也已构建了较多的真核细胞表达质粒载体系统,由于这类载体多有商品供应,类型的特色厂家已有介绍,故本文不再叙述。

  2.2  阳离子多聚物载体 

  阳离子多聚物(cationic polymer)载体是用带正电多聚物静电结合、浓缩DNA,再通过静电作用结合细胞膜或通过携带的靶向配体与存在于细胞膜上的受体结合,内吞进入细胞内。目前常用的主要有聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、树状高分子载体、明胶、壳聚糖及其衍生物等。然而由于存在电荷相关毒性及较病毒载体低的转染率等缺点,其临床应用也受到限制。近年来,随着材料及合成技术的飞速发展,人工合成的生物可降解阳离子多聚物主要用于制备纳米级载体[10]。

  2.3  纳米粒 

  纳米粒(nanoparticles) 是一类由天然高分子物质或合成高分子材料制成的粒径为纳米级的载体,其表面经过生物修饰或理化修饰后具有靶向作用。Iwasaki Y等的研究显示表面存在乙肝病毒的L抗原的L纳米粒具有嗜肝细胞性,其体内试验结果首次证明了纳米粒可用于将抗肿瘤的治疗基因导入人类肝脏肿瘤,值得关注[11]。而对脑肿瘤来说,利用人脑肿瘤原发部位的血管间隙较大、通透性增强和滞留效应,抗肿瘤药物的转运可通过直径小于80nm的纳米载体实现[12]。尽管如此,但纳米靶向载体还是存在着药物装载量偏低,靶向物质与药物载体结合的稳定强度低,靶向性药物存在毒性和组织特异性不理想,体内环境中纳米载体难以检测等系列问题,尚待深入研究。

  2.4  阳离子脂质体 

  脂质体(1iposome)载体为脂质双分子层组成的环形封闭囊泡,它可通过被宿主细胞融合、内吞等方式将其所携带的核酸分子送入细胞。脂质体转染无插入突变的危险,而且无毒、无免疫原性,是近年发展起来的非常有前途的非病毒载体。但普通脂质体作为药物载体,仍存在靶分布特性不理想、贮存中稳定性欠佳等缺点,因而限制了脂质体在肿瘤化疗中的应用[13]。

  2.5  活菌载体 

  基于实体瘤微环境缺氧的特性构建的重组厌氧菌载体,能特异性定居于肿瘤,通过产生细胞因子、毒素、酶类等活性物质或表达其所携带的目的基因起到治疗作用,现已初步显示出应用潜力。用于肿瘤基因治疗的厌氧菌载体具有以下特点:(1)易于生产,便于储存,使用更加方便;(2)可以作用于间质细胞,比病毒更易于从循环中清除,安全性高,其本身的抗瘤效果优于病毒;(3)治疗基因整合、发生遗传突变的可能性也减少;(4)靶向性优于病毒载体和脂质体载体。但厌氧菌载体也有其局限性:溶瘤治疗仅作用于厌氧区,这将阻碍专性厌氧菌穿透肿瘤间质“寻找”低氧区[14]。据目前研究来看,工程化厌氧菌和联合治疗的优化将有利于提高厌氧菌抗肿瘤治疗的疗效。目前研究较多的应用于肿瘤基因治疗的厌氧菌载体有双歧杆菌、沙门氏菌、梭状芽孢杆菌、乳酸杆菌等。

  2. 5. 1  双歧杆菌属

  双歧杆菌(Bifidobacterium)是寄居在人体和其他哺乳动物的肠道内的益生菌, Yazawa等[15]将长双歧杆菌鼠尾静脉注射入荷瘤小鼠,结果发现长双歧杆菌能够选择性在肿瘤组织内定植和生长而不累及正常组织,具有较好的靶向性,且未见小鼠出现由细菌进入体内所导致的任何不良反应。齐占朋等[16]通过对双歧杆菌表面分子完整肽聚糖(WPG)的研究发现,WPG能够抑制大肠癌Lovo细胞的增生,其机制与诱导癌细胞早期凋亡有关。与其他厌氧菌相比,双歧杆菌抗原性相对较弱而安全性较高,非常适宜作为基因治疗的载体,具有良好的应用前景和广阔的发展空间。

  2. 5. 2  沙门氏菌属 

  沙门氏菌属(Salmonella)是一种G-兼性厌氧菌,属于胞内寄生菌。Che-Hsin Lee等[17]的实验表明携带内皮抑素表达的猪霍乱沙门氏菌载体能显著抑制肿瘤生长。以减毒沙门菌为肿瘤治疗基因的载体,通过口服途径使外源基因定位到肿瘤组织产生效应,避免了全身用药的不良反应 [18]。此外,周易明等[19]的研究表明基因工程减毒的沙门氏菌VNP20009有着良好的低毒性以及肿瘤靶向性,具有作为肿瘤基因治疗载体的潜力。

 2.5. 3  梭状芽孢杆菌属及乳酸菌 

  梭状芽孢杆菌属 (Clostridium)为一大类厌氧或微需氧的G+粗大杆菌,其某些菌种可以产生毒性很强的外毒素和侵袭性酶类,对人或动物致病。乳酸菌(Lacticacidbacterium,LAB)是在人类消化道、阴道、口腔黏膜中长期黏附和定居的非致病性G+厌氧菌。实验表明,乳酸杆菌是一种靶向性非常强的非致病性厌氧菌。近年来,Aires等[20]研究发现经过基因改造的乳酸杆菌可以很好地表达HPV-16 VI Ps病毒颗粒,用乳酸杆菌携带VI Ps病毒颗粒做黏膜疫苗治疗子宫颈癌。

  3  结 语

    理想的肿瘤基因治疗载体具备以下特点:安全、有效,靶向性好、可调控、长期稳定、容量大、易选择、易转移、穿透性能好、适度表达和制备方便等。现实应用的载体均不能达到理想标准。病毒性载体虽然转染效率高,但其免疫原性、细胞毒作用、携带外源基因的大小受限和病毒滴度不易提高等问题使其研究和应用受到一定限制;非病毒性载体虽然突出的优点就是安全、制备简单和巨大的携带外源基因的容量,但其转染效率较低且基因的表达时间较短也影响其应用;细菌具有侵袭性和靶向性,能够进入细胞并导入外源基因,且易于控制,是细菌成为高效特异的新型肿瘤基因治疗载体的有利条件,但是也存在着在体内的表达效率还不够理想的问题,部分厌氧菌仍存在安全隐患,还需要进行大量探索。

    基因治疗载体存在着上述问题,使得肿瘤的基因治疗任重而道远。尽管目前肿瘤的基因疗法的研究大多还停留在实验研究阶段,相信在不久的将来,随着理想载体的研发使用,该疗法将会成为一种治疗癌症的重要手段被广泛应用于临床实践。

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