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lican8341的博客

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日志

 
 

ERK信号转导通路在哮喘大鼠气道重塑中的作用  

2014-11-30 22:54:19|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的 研究在哮喘大鼠气道平滑肌细胞ASMC(airway smooth muscle cell)中ERK信号转导通路对哮喘气道重塑中的作用。方法 原代培养ASMC,实验设未干预组(A组)、ERK阻断剂(U0126)组(B组)、PDGF组(C组)、PDGF+ERK阻断剂组(D组)。B组又分为B1组、B2组、B3组、B4组,加入浓度分别为0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的U0126;C组又分为C1组、C2组、C3组、C4组,加入浓度分别为1μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L的PDGF-BB。免疫组化法测ERK1蛋白的表达(仅测A、B4、C4、D组),RT-PCR法测其mRNA表达。结果 ASMC中ERK1蛋白表达B4组显著低于A组(P<0.01),C4组显著高于A组(P<0.01),D组与A组相比差异无统计学意义(P>0.05);B1组、B2组、B3组、B4组ERK1 mRNA表达均显著低于A组(P<0.01),U0126以浓度依赖性的方式抑制PDGF-BB诱导ASMC中ERK的活化;C1组、C2组、C3组、C4组ERK1 mRNA表达均显著高于A组(P<0.01),ERK1 mRNA的表达与PDGF-BB存在明显的浓度依赖关系,D组则与A组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 PDGF可剂量依赖地激活哮喘大鼠ASMC内的ERK通路,ERK通路参与了PDGF诱导的ASMC增殖的细胞内信号转导过程。

【关键词】  哮喘 大鼠 气道重塑 气道平滑肌细胞

【Abstract】  Objective  To explore the effect of ERK signal pathway on airway remodelling in ariway smooth muscle cells of asthmatic rats. Methods  Smoth muscle cells of asthmatic rats were cultured and divided into four groups: control group(groupA),ERK blocking agent group (U0126) group(groupB), PDGF group(groupC), PDGF+ERK blocking agent group(groupD);and correspondingly group B was divided into four subgroups of groupB1、groupB2、groupB3、groupB4,interfered the ASMC with ERK specific inhibitor U0126 0.1μmol /L、1μmol /L、5μmol /L respectively;group C was divided into four subgroups of group C1、groupC2、groupC3、groupC4,intervered the ASMC with recombinated rat PDGF-BB1μg /L、10μg /L、25μg /L、50μg /L respectively.The protein expressions of ERK1were detected by immunohistochemistry technique,The mRNA expressions of ERK1 were detected by RT-PCR. Results  The expression of ERK1 protein in ASMC of group B4 were significantly lower than that in group A(P<0.01), group C4 were significantly higher than group A(P<0.01), there were no significant difference between group D and group A(P>0.05);the expressions of ERK1 protein in ASMC of group B1、 B2、 B3、 B4 were significantly lower than group A(P<0.01), group C1 、C2、 C3、 C4 were significantly higher than group A(P<0.01), there were no significant difference between group D and group A(P>0.05). Conclusions  In ASMC, PDGF can dose-dependentandly induce the proliferation of ASMC and U0126 can block its effect.ERK signal pathway has very important effect on this process.

    【Key words】  Asthma  Rats  Airway remodeling  Airway smoth muscle cells 

   气道重塑(airway remodelling)是支气管哮喘(简称哮喘)的特征性病理生理改变之一,1992年哮喘“气道重塑(airway remodeling)”的概念被明确提出。气道平滑肌细胞(ASMC)增殖在气道重构中占有十分重要的地位,有报道显示哮喘病人气道平滑肌厚度是对照组的3倍[1],故体外气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMC)培养是研究哮喘发病机制的重要手段。ERK信号转导通路广泛存在于多种细胞内,是MAPK信号通路的3个家族成员之一,已发现它在气道平滑肌上广泛分布,主要以ERK1、ERK2两种亚型存在[2,3]。ERK主要介导生长因子如血小板源性生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastgrowth factor, bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF21)等的细胞内信号传导,调节细胞的增殖、分化、迁移等生物学行为。本实验中通过体外培养哮喘大鼠气道平滑肌细胞、PDGF-BB刺激哮喘大鼠气道平滑肌细胞增殖,以及ERK特异性抑制剂U0126阻断ERK通路后,观察ERK1蛋白及其mRNA在哮喘大鼠气道平滑肌细胞内表达情况,探讨ERK信号通路对哮喘气道重塑的作用。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料  (1)主要试剂:DMEM培养基(法国Biowest公司),胎牛血清(法国Biowest公司),胰蛋白酶(法国Biowest公司),大鼠抗小鼠α-actin单克隆抗体(武汉博士德公司),兔抗大鼠Smad 6/7多克隆抗体(美国Santa Cruz公司),重组大鼠PDGF-BB(美国R&D公司),U0126(美国Cell Singnal Technology公司),Trizol(美国Invitrogen公司),RT-PCR试剂盒(美国Fermentas公司),ERK1和GAPDH引物(上海生工合成)序列如下:ERK1上游引物:5′-GACTCCTACCTGAAGCATAC-3′,ERK1下游引物:5′-TCCTTGACACGCAGAATG-3′,产物203bp;GAPDH上游引物:5′-CAAGTTCAACGGCACAGTCAA-3′,GAPDH下游引物:5′-TGGTGAAGACGCCAGTAGACTC-3′,产物140bp。(2)实验动物:SPF级健康雄性SD(Sprague-Dawlay)大鼠5只,4~6周,体重120~160g,温州医学院动物实验中心提供。

    1.2  实验方法  (1)哮喘动物模型的建立:致敏阶段,第1天和第8天腹腔注射OVA/Al(OH)3混合液1.5ml[内含OVA1mg和Al(OH)3100mg];激发阶段,第15天开始以1%OVA生理盐水溶液雾化吸入,隔天1次,每次30min,共60d,以备下一步哮喘大鼠ASMC培养所用。(2)哮喘大鼠ASMC的培养和鉴定:取已建立哮喘模型大鼠,以胶原酶-胰酶混合消化法培养哮喘大鼠ASMC,细胞生长融合后,用0.25%的胰蛋白酶消化,以(107~108)·L-1的密度传代培养,对细胞进行形态学观察并对细胞内平滑肌肌动蛋白α-actin进行免疫细胞化学染色,>95%的细胞呈阳性着色,证实细胞为ASMC;取生长状态良好的3~5代细胞用于实验。(3)哮喘大鼠ASMC的分组:哮喘大鼠ASMC按加入药物及浓度的不同分为未干预组(A组),加无血清DMEM 2ml;ERK阻断剂组(B组),根据药物干预浓度不同分为B1、B2、B3、B4四组,分别加含U0126浓度为0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L的DMEM 2ml;PDGF组(C组),根据药物干预浓度不同分为C1、C2、C3、C4四组,分别加浓度1μg/L、10μg/L、25μg/L、50μg/L的DMEM 2ml;PDGF+ERK阻断剂组(D组),加含PDGF-BB和U0126的浓度分别为50μg/L和10μmol/L的DMEM 2ml。(4)哮喘大鼠ASMC的药物干预:细胞按6×103/cm2的密度接种于6孔板,待细胞长至接近融合时,吸出培养液,D-Hanks液洗细胞,加入含1%胎牛血清的DMEM/F12培养液,细胞饥饿24h,使细胞同步化于G0期,加入不同浓度的PDGF-BB和U0126,作用一定时间后,无血清培养基洗细胞,等待下一步实验。

    1.3  免疫组化SP法检测细胞ERK1蛋白表达  哮喘大鼠ASMC内ERK1蛋白的表达:从6孔板内取出爬有细胞的盖玻片,用SP法对细胞进行染色,胞质内棕黄色沉淀为阳性结果,应用image-pro plus图像分析软件测定阳性部位的平均吸光度(mean optical density,MOD),用以代表阳性部位的蛋白表达水平。

    1.4  RT-PCR法测ASMC内ERK1 mRNA的表达  提取哮喘大鼠ASMC总RNA,取1μl RNA样品加99μl DEPC处理的水中,混匀,采用紫外分光光度法测定OD260、OD280的值。RNA纯度以OD260/OD280的比值表示,要求比值在1.8~2.0之间。反转录反应体系体积为30μl,GAPDH和ERK1同管扩增,每管加总RNA约1μg。RT-PCR反应条件为:42℃反转录60min,94℃预变性5min,然后92℃ 30s,54℃ 30s,72℃ 30s反应37个循环,72℃充分延伸8min,4℃终止反应。产物用2%琼脂糖电泳,用SmartView凝胶数字成像系统扫描分析扩增产物条带,ERK1 mRNA的相对含量用ERK1与GAPDH吸光度的比值表示。

    1.5  统计学分析  用SPSS 10.0软件对数据进行分析,数据均以(x±s)表示,两组样本均数比较采用t检验,多组样本均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。

    2  结果

    2.1  ASMC内ERK1蛋白表达  ASMC中ERK1蛋白表达,B4组(0.18±0.05)显著低于A组(0.31±0.03),经统计学分析,P<0.01;C4组(0.68±0.02)显著高于A组(P<0.01);C4组显著高于B4组(P<0.01);D组(0.33±0.02)与A组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。见图1,表1。

    A: 免疫组化法示ASMC中A组ERK1表达  B: 免疫组化法示ASMC 中B组ERK1表达降低C: 免疫组化法示ASMC中C组ERK1表达增加  D: 免疫组化法示ASMC中D组ERK1表达无明显变化图1  各组ASMC内ERK1蛋白的表达(×200)表1  免疫组化检测各组哮喘大鼠气道平滑肌细胞ERK1蛋白表达注:与A组比较,*P<0.01

 2.2  ASMC内ERK1 mRNA的表达  B1组、B2组、B3组、B4组ERK1 mRNA表达均显著低于A组(P<0.01),U0126以浓度依赖性的方式抑制PDGF-BB诱导ASMC中ERK的活化;C1组、C2组、C3组、C4组ERK1 mRNA表达均显著高于A组(P<0.01),ERK1 mRNA的表达与PDGF-BB存在明显的浓度依赖关系,D组与A组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图2,表2。表2  各组ASMC ERK1 mRNA的表达注:与A组比较,*P<0.01;与B1组比较,△P<0.01;与B2组比较,○P<0.01;与B3组比较,☆P<0.01;与C1组比较,#P<0.01;与C2组比较,★P<0.01;与C3组比较,▲P<0.01。

    3  讨论

    3.1  PDGF促ASMC增殖的作用及可能机制  PDGF主要存在于血小板α颗粒中,当血小板粘附于损伤组织,暴露于凝血酶、胶原和二磷酸腺苷时,PDGF就被释放出来。另外,单核巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、系膜细胞等均可产生和释放PDGF。损伤的内皮细胞、激活的血小板、移行于内皮下的单核巨噬细胞及表型转化后的合成型平滑肌细胞能以自分泌、旁分泌连锁放大反应形式释放大量的PDGF。释放的PDGF能促进成纤维细胞、神经胶质细胞、平滑肌细胞(SMC)的有丝分裂,尤其对SMC的作用更明显,使细胞由G1/G0的静止期进入到细胞周期的增殖期[4]。PDGF包括PDGF-A与PDGF-B两个同分异构体,PDGF蛋白家族由4个基因(PDGF-A,-B,-C,-D)编码,包括4同二聚体(PDGF-AA、PDGF-BB、PDGF-CC、PDGF-DD)及1个异二聚体(PDGF-AB)五个亚型,其相应的受体有α与β两个亚型(PDGFRα及PDGFRβ),属于典型的酪氨酸蛋白激酶型受体。研究表明,PDGF与平滑肌细胞的增殖有关,在人造血管中是肌内膜超常增生的关键因子之一[5]。PDGF受体酪氨酸激酶抑制剂能阻止动脉增生性疾病。Warshamana等[6]研究鼠3T3成纤维细胞过程中发现地塞米松能正向调节PDGF受体,间接地激活PDGF受体表达从而导致肺成纤维细胞增殖。另有研究[7]也发现激素重症依赖性哮喘支气管粘膜活检检测到PDGF-BmRNA的表达,并明显高于轻症及健康对照者,提示PDGF参与了哮喘的气道重塑,研究显示哮喘肺部PDGF-B mRNA主要表达于EOS,同时指出哮喘慢性炎症作用下,外周血的EOS被激活同样表达PDGF-B mRNA。

    PDGF的作用机制与PDGF和其受体结合、受体酪氨酸磷酸化、胞浆游离Ca2+浓度的变化等有关,对于PDGF引起ASMC增殖的分子机制,目前有二种推论:一是PDGF受体在细胞膜外部分携有与PDGF特异结合的类似免疫球蛋白的5个结构域,在胞浆区则有酪氨酸磷激酶插入区,PDGF与受体结合后激活受体上的酪氨酸蛋白激酶,进而激活磷脂酶C(PLC),水解二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)产生三磷酸肌醇(IP3)和甘油二酯(DAG),IP3与内质网上特异受体结合,通过Ca2+的释放,使胞浆内游离Ca2+增加,DG和Ca2+激活蛋白激酶C(PKC),继而Ca2+和PKC活化促进DNA的合成;二是PDGF与受体结合后激活膜上的一种小分子G蛋白(ras蛋白),通过ras/GTP逐级激活MAPKKK/MAPKK/ERK通路,促进细胞的有丝分裂。

    3.2  ERK信号转导途径在哮喘气道重塑中的作用  目前认为在哮喘肺内很多因子是通过ERK和p38 MAPK途径激活气道平滑肌释放的[8]。早期的很多研究发现ras-ERK途径的激活对于细胞增殖,DNA合成和细胞周期调控起重要作用。对中重度哮喘患者和健康者的支气管标本活检研究发现,重度哮喘患者支气管上皮和平滑肌细胞磷酸化ERK 1/2和磷酸化p38强表达,与中度哮喘患者和无哮喘者有显著差异,得出1/2和p38通路调节上皮细胞的分泌和增殖功能的结论[9]。国内也有研究发现,制作哮喘大鼠模型后,对哮喘组、激素组、对照组进行研究,哮喘大鼠血清PDGF-AB浓度和磷酸化ERK以及c-Fos浓度高于对照组和激素组,糖皮质激素能抑制哮喘大鼠ERK以及c-Fos的磷酸化,并在一定程度上抑制支气管壁厚度和平滑肌厚度[10]。

    本课题以PDGF-BB作为ERK信号通路的上游一个代表物,来进一步证实体外培养哮喘大鼠气道平滑肌中是否存在ERK信号的激活。首先用PDGF作用于哮喘大鼠ASMC后,发现哮喘大鼠ASMC内的ERK蛋白及ERKmRNA明显增多,ERKmRNA增多与PDGF-BB存在明显的浓度依赖关系,50μg/L PDGF-BB诱导了ERK最强的活化,使用U0126阻断ERK通路后,PDGF诱导ERK蛋白增多的效应完全被阻断,ERKmRNA明显减少,U0126以浓度依赖性的方式抑制PDGF-BB诱导上皮细胞ERK的磷酸化,说明PDGF可剂量依赖地激活哮喘大鼠ASMC内的ERK通路,ERK通路参与了PDGF诱导的ASMC增殖的细胞内信号转导过程。

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