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lican8341的博客

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日志

 
 

人杀菌/渗透增强蛋白N末端片段表达载体的构建  

2014-12-15 20:22:21|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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[摘  要]目的:建立杀菌/渗透增强蛋白(BPI) N端193个氨基酸的重组表达质粒。方法:利用RTPCR的方法从HL60细胞内扩增出BPI氨基端1~193个氨基酸的基因序列,克隆入T载体。将BPI 193基因片段定向克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组的原核表达质粒pETBPI 193,转化大肠杆菌BL 21菌株。结果:从HL60细胞中扩增得到579 bp的BPI 193基因片段,构建了TBPI 193亚克隆和PETBPI 193重组表达质粒。结论:成功构建了pETBPI 193重组表达质粒。

  [关键词]  杀菌/渗透增加蛋白;基因表达;大肠杆菌

  The Construction of Human Bactericidal/Permeability Increasing Protein Nterminal Fragment Expression Vector  

  Abstract: Objective To construct a prokaryotic expression vector encoding first 193 amino acids of BPI Nterminal.  Methods Total RNA was extracted from HL60 and then was amplified by using RTPCR. The PCR product was cloned into pMD18T vector. BPI 193 cDNA was directly inserted into pET28a plasmid with T4 DNA ligase. pETBPI 193 recombinant expression vector was transformed into competent E.coli BL 21 and protein expression was induced by IPTG. Results A 579 bp fragment was amplified by RTPCR. BPI cDNA was inserted into pET28a.Conclusions pETBPI 193 recombinant expression vector was constructed successfully.

  Key words:Bactericidal/permeability increasing protein;Gene expression; E.coli

  感染是临床各科最常见的疾病之一。虽然近年来新型化学抗菌药物不断问世,但G菌败血症引起休克死亡的比率仍然很高,迄今尚未获得有效的解决办法,临床治疗急需要新的抗G菌感染的药物。杀菌/渗透增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是对细菌高度稳定的非催化阳离子抗菌蛋白,主要存在于人及哺乳动物中性粒细胞嗜天青颗粒中,也可微量表达于中性粒细胞和单核细胞表面,还可表达于嗜酸性粒细胞和上皮细胞等中,它不仅具有特异性杀伤G菌的作用,还可以中和内毒素,是一种具有广阔应用前景的“新型抗生素”[1~4]。本研究拟构建BPI氨基端(BPI 193)克隆入T载体以增强连接效率,并通过定向克隆的方式构建原核表达载体,为进一步研究BPI体内外的生物活性,研发新的BPI产品创造条件[5]。

  1  材料和方法

  1.1  细胞株、菌种和质粒HL60细胞株由第四军医大学微生物学教研室雷迎峰博士惠赠。E.coli DH5α和E.coli BL 21为本室保存菌株。pMD18T 载体为TaKaRa公司产品。pET28a原核表达质粒为Novagen公司产品。

  1.2  主要试剂Trizol为Invitrogen公司产品。cDNA第一链合成逆转录试剂盒购自Fermentas公司。XhoⅠ、BamHⅠ限制性内切酶,Taq DNA 聚合酶,T4 DNA连接酶均为TaKaRa公司产品。DEPC为sigma公司产品。小剂量质粒提取试剂盒和DL2000 DNA marker购自北京天为时代公司。小分子量蛋白marker购自华美公司。1640培养基购自Gibco公司。

  1.3  引物的设计与合成根据GeneBank数据库已收录的BPI cDNA的基因序列,借助于软件Primer Premier 5.0和DNA club设计了扩增BPI 1~193个氨基酸的上下游扩增引物。

  在引物的5'端分别添加了BamHⅠ和XhoⅠ两个酶切位点,以确保酶切后插入pET28a原核表达载体,并且读码框正确,还添加了起始密码ATG和终止子TAA。扩增的BPI位于124~702 bp,DNA长度为579 bp。引物由北京三博远志生物技术有限责任公司合成。

  1.4  方法

  1.4.1  RTPCR扩增目的基因:用trizol试剂从HL60细胞中提取总RNA,按试剂盒说明反转录出cDNA第一链后PCR扩增目的基因。经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分析结果后,用凝胶回收试剂盒回收PCR产物。通过1%的琼脂糖凝胶电泳观察回收情况并目测定量。

  1.4.2  PCR产物与T载体的连接及鉴定:按照pMD18T载体说明书,进行PCR回收产物与pMD18T载体的连接反应。将连接产物转化感受态E.coli DH5α,经抗生素和蓝白斑筛选出阳性菌落,用PCR、限制性内切酶分析和DNA测序证实BPI 193是否插入T载体以及基因序列有无突变。

  1.4.3  pETBPI 193重组质粒的构建:分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切TBPI 193和原核表达载体pET28a,酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳后,凝胶回收试剂盒回收,DNA定量后在T4 DNA连接酶的作用下将BPI 193定向克隆入原核表达载体pET28a中,构建重组的原核表达质粒pETBPI 193。转化大肠杆菌BL 21菌株,筛选出阳性菌落,并采用PCR和限制性酶切技术鉴定,得到表达菌。

  1.4.4  目的蛋白的诱导表达:用IPTG诱导表达菌,应用SDSPAGE技术检测细菌蛋白表达情况,计算机薄层扫描分析表达目的蛋白占菌体总蛋白百分比。

2  结果

  2.1  RTPCR扩增结果RTPCR反应后取5 μl经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,结果扩增出约602 bp的基因片段,与预期大小相符(见图1)。

  2.2  BPI 193基因片段与T载体的连接将获得的BPI 193基因片段RTPCR的产物凝胶回收后,按照pMD18T载体说明书操作,将目的基因与T载体连接,转化E.coli DH5α,在AMP+ LB培养基上进行蓝白斑筛选,经PCR和BamHⅠ+XhoⅠ双酶切检测,PCR扩增出约602 bp片段,双酶切结果切出约585 bp和2 690 bp左右的基因片段,与预期相符(见图1)。送上海华诺公司测序,证明BPI 193基因序列完全正确,命名为TBPI 193。

  2.3  pETBPI 193重组质粒的构建用BamHⅠ和XhoⅠ分别双酶切TBPI 193和pET28a质粒,凝胶回收试剂盒回收得到纯化产物。用T4连接酶连接,转化E.coli DH5α,卡那霉素筛选细菌,并进行PCR和BamHⅠ+XhoⅠ双酶切鉴定,PCR扩增出约602 bp的基因片段,双酶切获得约585 bp和5 329 bp的基因片段,与预期相符(见图2)。

  2.4  BPI 193重组蛋白的表达IPTG诱导表达菌BL 21,进行SDSPAGE电泳分析,发现诱导后21 KD左右处有蛋白表达,与预期相符。可溶性分析表明表达的BPI 193重组蛋白以包涵体的形式释放(见图)。薄层扫描分析,表达蛋白量占菌体总量的12%左右。

  3  讨论

  本实验从DNA水平到蛋白水平都获得了与文献报道一致的实验结果,证实了BPI 193重组表达载体构建成功。传统制备BPI 多采用柱层析的方法,国外获得BPI N端功能性片段及其衍生物多采用真核系统表达[6~7],但这些方法生产条件要求比较高,消耗巨大,影响了临床应用。研究表明BPI糖基化部位与蛋白的活性没有显著关系,BPI是否糖基化对于抗体与抗原的识别来说没有明显影响[8]。本研究采用原核表达系统表达BPI 193重组蛋白,具有传统方法无可比拟的优点,大大降低了生产成本,为后续的实验研究奠定了基础。本研究选用pET28a作为原核表达载体,它含有T7启动子,是一种T7噬菌体表达系统,其多克隆位点上游有6个组氨酸和凝血酶位点,可利用固化Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白。还可以用凝血酶切割纯化的融合蛋白,从而获得重组的目的蛋白。BPI 193基因片段被定向克隆于pET28a原核表达载体后,其N端与6个组氨酸形成融合蛋白,并在IPTG的诱导下得以表达。经蛋白的可溶性分析显示,BPI 193与组氨酸融合蛋白在细菌中主要以包涵体的形式进行表达,而在细菌裂解液上清中没有检测到BPI 193融合蛋白。文献中提示,几种利用原核表达系统表达人BPI时,目的蛋白也总是以包涵体的形式释放。我们推测可能与以下因素有关。①大肠杆菌BL 21进入对数生长期时间短,生长速度快,由于细菌生长过度或者生长过速加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。②BPI 193是BPI N末端前193个氨基酸,包含了三个与生物活性密切相关的区域,具有完整BPI特异性杀伤GNB、结合及中和LPS的能力。大肠杆菌本身就是革兰氏阴性菌,因此对于E.coli BL 21来说,BPI 193重组蛋白具有细胞毒性,可能会对细菌产生杀伤作用。所以细菌在合成过程中将蛋白纳入包涵体中,消除或减弱蛋白的生物活性,减轻对宿主菌的毒性作用。BPI 193重组蛋白以包涵体的形式存在有助于表达产物的分离和提取,也可以减少胞内蛋白酶对蛋白的破坏和降解,因此,在本实验中具有有利的方面。但是要获得具有功能性的重组蛋白还需要进行复性处理,恢复蛋白的空间结构和生物活性,这给生产使用带来一些麻烦,在今后的实验工作中还需要进一步研究。虽然经过多种方法优化蛋白表达条件,但是BPI 193融合蛋白的表达量仍然很低,经分析只占菌体总蛋白的12%左右。这可能是因为,诱导条件没有达到最优,诱导前后细菌培养的条件不合适。Bluow等[9]研究发现,完整的BPI以及含有BPI C端和LBP N端的嵌合体都可以稳定的储存在细胞中,而缺失了C端的BPI在储存过程中会被降解。所以推测,部分BPI 193与组氨酸的融合蛋白在表达过程中可能被细菌降解。

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