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日志

 
 

人NK细胞体外高效扩增的实验研究  

2014-12-15 20:31:51|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】    目的: 建立人NK细胞体外大量扩增的方法。方法: 采用基因工程方法, 在K562细胞上同时表达IL15、 IL18、 41BBL 3种基因, 构建特定的K562工程细胞作为刺激细胞。IL15、 IL18基因分别与一段特殊的跨膜蛋白基因融合, 41BBL直接跨膜表达, 使这3种蛋白在K562细胞中表达后锚定于细胞膜表面。其次, 以照射致死的该K562工程细胞作为刺激细胞, 以人外周血单个核细胞(PBMC)为扩增培养对象, 通过与IL2的共刺激作用, 使NK细胞在体外培养条件下得到大量的扩增。结果: 经过21 d的刺激培养后, CD56+CD3-细胞数量扩增了(520±75)倍。CD56+CD3-细胞的纯度从培养前占PBMC的7%±4%到扩增后占总细胞比例的93%±3%。PBMC中的T细胞基本上没有得到扩增, 扩增后的细胞中CD3+细胞只占2%±1.2%。扩增的细胞具备了NK细胞的基本特征和生物学特性, 除了CD56+CD3-外, 还对扩增的NK细胞上NKG2D、 NKp46、 NKp44、 NKp30、 CD94、 CD158b、 CD158a、 NKB1、 NKAT2等标记进行了验证。细胞毒实验表明, 在效应细胞∶靶细胞为5∶1时, 扩增的NK细胞的杀伤率达到了95%±4%。结论: 建立的NK细胞体外扩增方法, 达到了较高的扩增水平, 且扩增的细胞活性较好。本方法以PBMC为原始材料, 能够实现NK细胞体外的大规模制备, 这将为抗病毒与抗肿瘤的NK细胞免疫治疗奠定基础。

【关键词】  扩增; 自然杀伤细胞; 白细胞介素15; 白细胞介素18; 41BB配体

  NK细胞(natural killer cell)的过继治疗在抗病毒、 抗肿瘤的治疗中有着广泛的应用前景, 在造血干细胞移植后减少移植物抗宿主反应中的作用也倍受关注[1, 2]。由于NK细胞在外周血中所占的比例很少, 建立一种有效的NK细胞体外扩增系统是深入研究NK细胞功能与探讨NK细胞免疫治疗的基础。体外获取人NK细胞主要有两种途径: 一是采用抗NK细胞特异性抗体与磁珠交联的方法, 从PBMC中分离人NK细胞; 二是采用刺激扩增培养的方法, 从PBMC中扩增培养人NK细胞。前者可以快速获得NK细胞, 但只适用于小规模的NK制备用于研究分析。后者则是以PBMC(或以磁珠分离的NK细胞)为原始材料, 通过特定细胞因子的刺激, 使NK细胞在体外得到特异的扩增[3, 4], 这种方法是目前被认为比较有应用前景的方法, 通过体外的刺激培养可进行相对大规模的NK细胞制备, 使临床应用成为可能。但是迄今为止多数的体外刺激扩增培养也只能使NK细胞在体外扩增数十到百倍, 且纯度也不理想。在刺激NK细胞生长上, 已知IL2、 IL15、 IL18和IL12等细胞因子在对NK细胞的生长与扩增是非常重要的, 其中IL15的作用尤为重要。除了细胞因子对NK细胞的生长具有促进作用外, 研究人员还注意到K562、 HFWT等肿瘤细胞也能够刺激NK细胞的扩增。研究表明, IL15处于细胞膜上比其可溶状态能更有力刺激NK细胞的生长[5, 6]。Imai等[7]研究证明, 如果单纯将K562细胞与可溶形式的IL15混合后刺激NK细胞, 结果与以往的单纯细胞因子刺激或者肿瘤细胞刺激相比没有太大的差别, 只能使NK细胞扩增数十倍。但是, 如果将IL15表达在K562细胞的表面(非可溶形式的IL15), 使IL15基因及41BBL基因与跨膜蛋白基因融合, 共同表达在K562细胞的膜表面。这样, 通过γ射线照射致死的该刺激细胞与PBMC的共同孵育(刺激细胞与NK细胞间的接触刺激), 经过3周时间的培养, NK细胞得到大量的扩增, 明显高于目前报道的各种扩增方法。我们在上述方法的基础上进行改进, 在K562细胞膜表面表达IL15与41BBL的同时, 将IL18也同时表达在K562细胞的表面, 以该细胞为刺激细胞, 对其在NK细胞扩增中的作用进行了实验研究。

  1  材料和方法

  1.1  材料  PBMC分别来自8个健康献血者(男女各4人), 其中年龄最大45岁, 最小22岁, 平均38岁。K562细胞、 含CD8α信号肽和穿膜区基因的真核表达载体本室已构建; IL15、 IL18、 41BBL cDNA分别从正常人淋巴细胞中扩增; 抗人CD56、 CD3、 CD94、 NKG2D、 NKp46、 NKp30、 NKp44、 CD158b、 CD158a、 NKB1、 NKAT2特异性抗体购自美国BD Biosciences公司及Coulter公司; NK杀伤活性检测采用日本同仁化学研究所(Dojindo)的Cell Counting kit8试剂盒。RPMI1640为Gibco BRL公司产品。

  1.2  方法

  1.2.1  表达IL15、 IL18、 41BBL K562细胞的构建  采用RTPCR方法分别从人PBMC中扩增IL15、 41BBL、 IL18 cDNA, 测序正确后, IL15、 IL18基因分别克隆至CD8α信号肽的下游、 CD8α跨膜区基因的上游。重组的IL15、 IL18、  41BBL再分别亚克隆至含有不同筛选标记的3种真核表达载体, 先后转染K562细胞后, 筛选稳定表达的细胞克隆, 构建了K562工程细胞株(以下简称K562D3细胞)。K562D3细胞应用前(与PBMC共培养前), 用γ射线灭活。

  1.2.2  NK细胞的刺激培养  新鲜分离的人PBMC, PBS洗3次后, 用含100 mL/L胎牛血清、 1×106U/L 可溶性IL2的RPMI1640培养液悬浮, 加入24孔板中, 每孔106个细胞; 随后每孔再另加γ射线灭活的K562D3细胞106个, 37℃、 50 mL/L  CO2孵箱培养, 第6天起每隔3 d对孔中的液体半换液, 培养21 d后收获细胞并用流式细胞术进行细胞分类分析, 确定CD56+CD3-细胞的比例。同时设以下平行对照组: 单纯K562细胞刺激组、 单纯加入K562细胞以及可溶性IL15/IL18刺激组、 表达IL15/41BBL/K562细胞刺激组、 单独表达41BBL的K562细胞组、 单独表达IL15的K562细胞组和单独表达IL18的K562细胞组。所有组的培养液均为RPMI1640含100 mL/L胎牛血清、 1×106 U/L可溶性IL2。

  1.2.3  NK细胞标志物的测定  扩增前的PBMC以及扩增培养21 d的细胞通过流式细胞术分析, 分别用CD56、 CD3抗体对扩增(培养)前后的细胞进行分类鉴定, 确认NK细胞的比例。同时还对扩增NK细胞的激活性受体和抑制性受体水平分别用CD94、 NKG2D、 NKp46、 NKp30、 NKp44、 CD158b、 CD158a、 NKB1、 NKAT2抗体, 通过流式细胞术进行评估。

  1.2.4  NK细胞杀伤活性测定  96孔培养板, 每孔含一定数量的NK细胞作为效应细胞, 另加入一定数量的K562细胞作为靶细胞, 两种细胞的数量比例根据效应细胞与靶细胞的比值要求而定, 总体积200 μL(液体为100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液), 37℃、  CO2培养箱4 h, 每孔加入20 μL cellcounting 试剂, 37℃、  CO2培养箱2 h, 450 nm波长测定吸光值(A), 计算杀伤率。同时设只有NK细胞以及只有K562细胞的对照孔。杀伤率=[1-(Ae+t-Ae)/At]×100%; Ae: 单纯效应细胞孔即NK细胞孔的A值; At: 单纯靶细胞孔即K562细胞孔的A值; Ae+t: 效应细胞加靶细胞孔的A值。

  2  结果

  2.1  K562D3细胞  构建的K562D3细胞通过抗41BBL 、 IL15和IL18抗体染色, 证明K562D3细胞同时表达了这3种蛋白。γ射线照射后的K562D3细胞经过2周的连续培养, 未见有存活细胞。照射后的细胞在3~6 d内仍然保持完整的细胞形状, 与PBMC混合后的该照射细胞在第5~6天后破碎并被逐渐吞噬干净。

  2.2  K562D3细胞与PBMC共培养后NK细胞的扩增  8份健康供血者PBMC细胞, 扩增前经流式细胞术分析, 确认CD56+CD3-细胞占总细胞的7%±4%, CD3+细胞(主要为T细胞)占总数的56%±8%(图1A)。K562D3工程细胞刺激组(PBMC与表达IL18/IL15/41BBL 的K562细胞共培养), 经过21 d刺激培养后, CD56+CD3-细胞占总细胞的93%±3%, CD3+细胞只占总数的2%±1.2%(图1B), NK细胞(CD56+CD3-)数量扩增了(520±75)倍。平行对照培养中, 表达IL15/41BBL 的K562细胞刺激组, 21 d后CD56+CD3-细胞大约扩增了(500±50)倍, CD56+CD3-细胞占扩增后总细胞数的91%±4%。K562细胞加可溶性IL15/IL18组, 21 d后NK细胞大约扩增了(50±10)倍; 单纯与K562细胞共培养组, 21 d后NK细胞大约扩增了(20±8)倍; 单独表达41BBL或单独表达IL15或单独表达IL18的K562细胞刺激组21 d后分别扩增了(80±26)倍、 (110±32)倍和(25±9)倍(图2); 各组之间, K562D3工程细胞刺激组与K562表达IL15/41BBL细胞刺激组, 这两组的扩增倍数接近(P>0.05, 无统计学意义), 但明显高于其余组(P<0.05)。

  2.3  扩增的NK细胞表面标记分析  对K562D3工程细胞刺激扩增的NK细胞, 除了用CD56、 CD3抗体予以确认外, 还采用流式细胞术分析, 对其他几种代表NK细胞特征性的受体CD94、 NKG2D、 NKp46、 NKp30、 NKp44、 CD158b、  CD158a、 NKB1和NKAT2分别进行了检测。结果证实这些标志性的受体在扩增的NK细胞中分别为CD94阳性95%、 NKG2D阳性95%、 NKp46阳性84%、 NKp30阳性62%、 NKp44阳性65%、 CD158b阳性20%、 CD158a阳性18%、 NKB1阳性30%、 NKAT2阳性20%。

  2.4  扩增的NK细胞杀伤实验  对K562D3工程细胞刺激组和IL15/41BBL K562细胞刺激组所扩增的NK细胞的杀伤能力进行了比较, 结果表明在效应细胞∶靶细胞为5∶1时, 两组的杀伤率分别为95%±4%和85%±7%; 在效应细胞∶靶细胞为2∶1时, 两组的杀伤率分别为75%±6%和60%±9%(图3); 两组NK细胞的杀伤率差别有统计学意义(P<0.05)。

图1  扩增前后的样品流式细胞术分析(略)

  Fig 1  Flow cytometry analysis before and after expasion

  A:  PBMC analyzed by flow cytometry before expansion;  B:  Expanded cells analyzed by flow cytometry on days 21 of expansion.

  图2  7组刺激成分对PBMC中NK细胞扩增效果比较(略)

  Fig 2  Expansion efficiency of 7 stimulators

  1:  K562D3(520±75);  2:  IL15/41BBL membrane bound K562 (500±50);  3:  K562 cell with soluble IL15 and IL18(50±10);   4:  K562 cell only(20±8);  5:  41BBL membrane bound K562 (800±26);  6:  IL15 membrane bound K562 (110±32);  7:  IL18 membrane bound K562 (25±9).

  图3  K562D3刺激扩增的NK细胞与K562表达IL15/41BBL刺激扩增的NK细胞杀伤率比较(略)

  Fig 3  Cytotoxicity between NK cells expanded by stimulator of K562D3 and NK cells expanded by stimulator of IL15/41BBL membrane bound K562

  A:  The cytotoxicity were 95%±4% for NK cells expanded by K562D3 and 85%±7% for NK cells expanded by IL15/41BBL membrane bound K562 at 5∶1 E∶T ratio. B:  Cytotoxicity were 75%±6% for NK cells expanded by K562D3 and 60%±9% for NK cells expanded by IL15/41BBL membrane bound K562 at 2∶1 E∶T ratio.

  3  讨论
    
  NK细胞在抗病毒、 抗肿瘤上扮演着重要的角色, 因其作用不需初次免疫活化, 因而在过继免疫治疗上有其独特的应用前景。由于不能获得数量大、 纯度高的人NK细胞, 使NK细胞在免疫治疗中的应用受到了限制。采用体外扩增的方法获得足够数量和较高纯度的人NK细胞, 是近年来研究NK细胞功能特别是探讨过继免疫治疗的一个重要基础平台。国内外学者在扩增的方法上进行了各种的探索, 如采用磁株分选的方法先从人PBMC中分离NK细胞, 获得的NK细胞在体外培养条件下, 用可溶性IL2、 IL12、 IL15等细胞因子共同刺激, 能使NK细胞扩增数十倍[3, 4]。除了细胞因子外,  K562、 HFWT等肿瘤细胞也能够刺激NK细胞的扩增, 采用照射致死的K562细胞或HFWT细胞与PBMC共培养, 也能使PBMC中的NK细胞得到一定的扩增[8]。在数量上, 上述这些扩增方法获得的NK细胞似乎还不能满足过继免疫治疗的需要, 仅仅靠可溶性细胞因子的刺激还很难使NK细胞得到大量的扩增。41BB与其配体41BBL 是一对重要的共刺激分子, 对于活化T细胞、 NK细胞以及介导免疫应答具有重要的作用。41BBL与IL15结合是PBMC中NK细胞得到特异扩增的基础, 而以非可溶形式表达的这两种蛋白, 通过细胞间的接触刺激则是使NK细胞大量扩增的主要原因。Imai等[7]建立的这种扩增方法是迄今为止扩增效率最高的一种方法。我们在综合这些方法的基础上对体外大规模扩增人NK细胞进行了探索。由于IL18是一种重要的NK细胞调节因子, 可以促进NK细胞的增殖、 活化、 杀伤及分泌等功能[9], 本研究在以膜蛋白形式表达41BBL与IL15的基础上, 构建了表达41BBL/IL15/IL18 3种成分的K562刺激细胞K562D3, 结果表明用K562D3扩增的NK细胞, 其细胞毒活性比IL15/41BBL/K562扩增的NK细胞提高了约10%, 扩增倍数达到了520倍。本扩增方法获得的NK细胞活性好(95%杀伤率)、 纯度高(93%), 且方法简便实用, 有望成为探索NK细胞过继免疫治疗的一重要平台。

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