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lican8341的博客

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日志

 
 

一种高效扩增人T细胞受体β链可变区基因的方法建立  

2014-12-15 20:34:38|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 建立一种高效扩增人T细胞受体(TCR)β链可变区(Vβ)基因的方法。方法: 根据TCR Vβ26个亚家族基因序列特点设计扩增Vβ基因的上游内引物34条、 上游外引物37条, 并将内、 外上游引物各分为8个简并组。在恒定区(C区)设计下游内、 外和测序引物各1条以及扩增Cβ基因的上游引物1条。提取细胞RNA, 用PolyA介导反转录后, 采用巢式PCR扩增正常人CD8 T细胞TCR Vβ26个亚家族基因, 并用Jurkat T淋巴瘤细胞作为对照。用Teasy载体克隆RTPCR 产物, 对克隆基因进行测序。结果: 从正常人的CD8 T细胞中扩增到所有TCR Vβ亚家族基因, 克隆后测序与相应的参考序列同源。从Jurkat细胞扩增出TCR Vβ8基因, 经测序验证与文献报道一致, 且最少可从10个细胞提取的RNA模板中扩增成功。结论: 建立的巢式RTPCR方法可以高效、 广谱地扩增人TCR Vβ基因, 为进一步进行抗原特异性细胞毒T淋巴细胞的TCR克隆和功能研究打下了良好基础。

【关键词】  CD8 T细胞; T细胞受体(TCR); 反转录PCR; 基因克隆

    [Abstract]  AIM:   To develop an effective assay for amplifying human Tcell receptor (TCR) variable region of β chain (Vβ)encoding genes.  METHODS:   Based on the property of the 26 subfamilies of human TCR Vβencoding gene sequence,  34 sets of outer and 37 sets of inner sense primers were divided into 8 degenerate primer groups,  and a set of outer and inner antisense primers located in conserved region β chain (Cβ) was designed for the amplification of the TCR Vβencoding genes. In addition,  a sequencing primer and a sense primer for amplifying Cβencoding genes were designed. CD8 Tcell RNA was extracted and subjected to reverse transcription mediated by poly A,  followed by a nested polymerase chain reaction (PCR) to amplify the 26 subfamilies of human TCR Vβencoding genes. Jurkat T lymphoma cells were used as control. Teasy vector was employed to detect DNA sequencing of the cloned target genes.  RESULTS:   All the subfamilies of the Vβencoding genes were obtained from CD8 T cells of a healthy donor,  except the subfamily of Vβ8 , was obtained from Jurkat cells. The results were confirmed by DNA sequencing of the cloned genes.  CONCLUSION:   The nested RTPCR assay can effectively amplify human TCR Vβencoding genes with broad spectrum,  which is helpful for the cloning and functional study of the TCR expressed by antigenspecific cytotoxic T lymphocytes.

    [Keywords]CD8 T cell;  Tcell receptor (TCR);  RTPCR;  gene cloning

T细胞受体(Tcell receptor,  TCR)是T细胞表面特异性识别抗原和介导免疫应答的分子, 可分为TCRα/β和TCRγ/δ两种类型, 外周血T细胞主要为TCRα/β的T细胞, 是介导机体特异性细胞免疫反应的主要细胞。TCRβ基因由可变区(V)、 多变区(D)、 结合区(J)和恒定区(C)四部分基因片段组成。在T细胞发育过程中V区、 D区和J 区进行重排而形成具有功能的TCR编码基因, 重排的过程中VD和DJ 之间可有不同数量的核苷酸随机插入或删减的现象, 这种基因片段连接的不准确性使TCR的表达呈多样性, 以识别各种不同的抗原[1]。因此, 分析TCR Vβ亚家族的表达和利用情况, 对阐明肿瘤、 自身免疫性疾病以及病毒感染等疾病的致病机制十分重要[2-4]。然而由于TCR Vβ的多样性, 采用已往报道用的RTPCR方法在T细胞数量很少以及TCR表达很微量的情况下扩增TCR基因灵敏度不高或代表性不够。本研究通过优化引物设计和应用巢式RTPCR使TCR Vβ的扩增具有很高的灵敏度和广泛的代表性。PCR产物进一步做DNA克隆, 挑取单克隆菌落测序, 了解TCR Vβ链的表达和分布情况, 为进一步研究病毒感染时特异性T细胞TCR的偏性取用(bias usage)和克隆性增殖的情况提供了方法学基础。

    1  材料和方法

    1.1   材料  用于分选CD8 T细胞的外周血单个核细胞(PBMC)来自1例男性健康成年人, Jurkat 淋巴瘤细胞为本室保存, MACS(Magnetic activated cell sorter)磁珠分选CD8 T细胞的试剂与分离柱和分离器购自德国Miltenyi Biotec公司, 荧光标记的抗CD3和抗CD8抗体购自美国BDPharmingen公司, 提取细胞RNA的RNessy mini盒、 PCR产物回收和凝胶电泳产物回收试剂盒均购自德国Qiagen公司, 反转录试剂盒和pGEM Teasy 载体均购自美国Promega公司。

    1.2  方法

    1.2.1  PBMC分离和CD8 T细胞分选  按照常规方法分离PBMC, CD8 T细胞的MACS磁珠分选操作方法按说明书进行。分选后的CD8 T细胞用荧光标记的抗CD3和抗CD8抗体染色、 流式细胞术(FCM)检测CD8 T细胞的纯度和数量, 用RPMI1640液调整细胞密度至 2×109/L备用。

    1.2.2  引物  根据文献资料[5,  6]和从GenBank下载的257条人TCR Vβ基因序列进行分析, 根据Vβ各个亚家族的基因序列特点, 在相对保守的信号肽区设计出相应的25个亚家族特异性上游引物(Vβ26亚家族基因为假基因, 故不设计实验), 因为有些TCR Vβ亚家族内部还分为几个不同的分家族, 故共设计了上游外引物34条和上游内引物37条; 在Cβ区设计下游外引物down1、 下游内引物down2、 测序引物down3各1条, 以及扩增Cβ基因的上游引物C1(表1)。引物由上海生工公司合成。表1  扩增TCR Vβ和Cβ编码基因的引物设计

    1.2.3  RNA提取和巢式RTPCR反应  CD8 T细胞或Jurkat细胞RNA的提取按照文献[7]的方法进行。应用(oligo)dT引物反转录合成cDNA第1链, 反转录反应条件为40℃ 1 h。以cDNA为第1轮PCR反应模板, 将上游外引物分为8组简并引物分别与down1进行8个PCR反应, PCR扩增总体积为25 μL/管, 反应条件为94℃ 5 min; 94℃ 30 s,  59℃ 30 s(每个循环递减1℃), 55℃ 30 s, 72℃ 1 min, 30个循环;  72℃  5 min; 68℃ 5 min。第2轮PCR反应以第1轮PCR产物为模板, 将对应的8组简并上游内引物分别与down2加入各反应管中, 反应体积为50 μL/管, 反应条件为94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 60℃ 1 min, 72℃ 1 min, 40个循环; 72℃ 5 min; 68℃ 5 min; Jurkat细胞RNA模板扩增基因片段长度为578 bp。一些实验中, 第2轮PCR反应使用单一上游引物分管反应, 以确定各亚家族引物的扩增效率。同时扩增βactin和TCR Cβ编码基因做为质控对照。RTPCR反应扩增TCRβ链编码基因的步骤示意见图1。

    1.2.4  DNA克隆  PCR产物于10 g/L琼脂糖凝胶(溴乙锭染色)中进行电泳分析, 挑取Vβ14亚家族基因的PCR产物做DNA克隆, 切取目的基因片段, 回收PCR产物, 与pGEM Teasy 载体连接。将重组质粒转入细菌JM109, 氨苄青霉素和Xgal 蓝白斑法筛选阳性菌落, 挑取15个单克隆白色菌落于10 μL H2O中 94℃加热10 min以裂解菌体后, 按第2轮PCR体系进行PCR反应, PCR经电泳鉴定后提取重组质粒进行测序, 测序引物为down3。

    1.2.5  序列对比  根据文献报道的标准序列号, 应用Vector NTI 软件的AlignX组件以及Virusblast软件, 将本实验所测的TCRVβ编码基因序列与已知各种TCR Vβ编码基因参考序列进行比对。

    2  结果

    2.1  RTPCR扩增TCRβ链编码基因  经反转录和用8组简并上游引物和下游引物介导二轮PCR扩增后, Jurkat细胞样本只有在含Vβ8亚家族引物的4B组扩增到了目的条带, 测序结果与文献报导一致, 为Vβ8; CD8 T细胞在分选后纯度为95.9%, 样本在8组中均扩增出目的条带(图2B); 用各种单一引物进行第2轮PCR反应时所有亚家族引物均可获得扩增条带, 图2B显示了以第1组上游简并引物介导的第1轮PCR产物为模板, 第2轮中采用同组5种单一上游引物扩增的结果。βactin和Cβ编码基因经一轮PCR扩增即可获得目的条带(图片未显示)。图2A显示用含Vβ8亚家族引物的第4组简并PCR引物, 分别以1 000个、 100个、 10个Jurkat细胞提取RNA的为模板, 经巢式RTPCR扩增的结果。

    2.2  基因克隆和序列分析  Vβ扩增产物经与Teasy载体连接后转化感受态受体菌, 经含氨苄青霉素、 Xgal和IPTG的平板筛选后, 随机挑出了15个克隆提取质粒进行菌落PCR和DNA序列分析。本研究的15个克隆序列与Vβ14参考序列的同源性均达到75%以上, 15个克隆的序列差异均主要在CDR3高变区, 保守区的序列均一致。

  3  讨论

    T细胞的特异性由TCR决定, 参与特异性细胞免疫应答的CD8 T细胞主要是TCRα/T细胞 , 其多样性和特异性产生于TCR受体α和 链基因的VDJ重排。TCRα、  链的V区约含102~109个氨基酸, 由二个半胱氨酸形成链内二硫键, 组成约含50~60氨基酸残基的环肽, 是特异性识别外来抗原的结构域[8]。根据核苷酸序列同源性 75%的原则, α链分属32个亚家族,  链分属26个亚家族, 一些亚家族内还包括若干个分家族。TCRα 的种类约有107,  是从大约108个不同的TCRα异质双聚体天然前体池(pool of naive precursors)中选择出来的, 估计其代表的多样性>1018[3,  9]。正常情况下PBMC应能表达所有Vβ亚家族基因, 不同的Vβ亚家族T细胞所执行的功能有所不同, 在一些疾病中CD8 T细胞中的细胞毒T淋巴细胞(CTL)TCR Vβ表达谱可发生特有改变。我们曾对中国人群流行的乙型肝炎病毒(HBV)特异性CTL的表位特点进行了分析[10], 如能进一步解析特异性CTL的TCR取用特点, 对阐明机体抗HBV特异性免疫应答机制将有重要意义, 同时克隆特异性CTL的优势TCR编码基因可用于抗HBV感染的基因治疗研究。

    本研究拟在建立一种高效灵敏的TCR Vβ编码基因扩增方法。有报道采用24条引物介导RTPCR反应扩增24个TCR Vβ亚家族编码基因, 观察到TCR Vβ亚家族表达的不均衡性。但该方法要求用于扩增的细胞模板量较高, 扩增的各种Vβ亚家族编码基因片段大小差异较大, 且有少数TCR Vβ亚家族编码基因未能检出[11, 12]。为了能更广泛地覆盖Vβ各亚家族/分家族基因的差异序列, 同时获得长片段的各个Vβ亚家族编码基因, 我们设计了两组上游引物分别为34条外引物和37条内引物, 采用巢式RTPCR技术, 保障了方法的序列兼容性和敏感性; 采用8组简并上游引物(每组含45个引物)进行反应, 再根据情况在第2轮PCR中采用单一引物, 有利于提高工作效率。研究结果表明所建立的方法可有效扩增各个Vβ亚家族编码基因, 最少可从10个Jurkat细胞提取的RNA中扩增成功。我们设计的PCR引物有很好的亚家族特异性, 但分家族特异性不高, 难以完全区分各分家族特异性, 因此即使用单一引物扩增到的Vβ编码基因在序列上仍有较大异质性, 用PCR产物直接测序效果较差, 但通过克隆测序可以准确分析优势表达基因的序列。在分析的Vβ14亚家族基因的PCR产物克隆基因中, 15个克隆序列与Vβ14亚家族基因的同源性均大于75%, 序列差异主要在CDR3高变区。我们下一步将建立高效敏感的扩增TCR Vα方法, 并通过综合分析抗原特异性CTL TCR的α链和β链的表达谱特点, 深入了解疾病状态下的细胞免疫应答机制。

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