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lican8341的博客

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日志

 
 

人疱疹病毒7型U14编码区原核表达载体的构建  

2014-12-16 20:54:45|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  疹病 
    [摘要]  目的  构建人疱疹病毒7型(HHV7)开放读码框(ORF) U14的原核表达载体,并且进行原核表达。方法  PCR技术扩增HHV7 ORF U14基因的主要抗原决定簇编码区(328~533氨基酸),目的基因与原核表达载体pThioHis A分别双酶切后连接,1×TSS法转化宿主菌E.coli BL21,异丙基βD硫代半乳糖苷诱导融合蛋白表达。结果  基因序列分析表明目的基因序列与HHV7标准毒株相应序列基本一致,SDSPAGE电泳可观察到相对分子质量为3.57万融合蛋白的表达,Western印迹证实pp85蛋白成功表达。结论  HHV7被膜蛋白pp85原核表达载体构建和表达成功,为进一步探讨该重组蛋白在HHV7特异性抗体检测中的应用提供实验基础。 
    [关键词]  疱疹病毒7型,人;被膜蛋白pp85;原核表达 
    [ABSTRACT]ObjectiveTo construct the prokaryotic expression vector of tegument protein pp85 of human herpesvirus 7 and to express it. Methods The major antigen epitopes coding sequence (328―533 aa) of HHV7 ORF U14 gene was amplified by PCR and inserted into the prokaryotic expression vector pThioHis A by gene engineering technique; recombinant plasmid was transformed into E.coli BL21 and expressed by IPTG inducing. ResultsThe target gene was identical with that of HHV7 standard species,and the 35 700 fusion protein was found in SDSPAGE and proved by western blot. ConclusionRecombinant prokaryotic expression vector was gained, which is valuable for the further study on HHV7 specific antibody detection. 
    [KEY WORDS]human herpesvirus 7; tegument protein pp85; prokaryotic expression 
    人疱疹病毒7型(HHV7)属β疱疹病毒,通常经唾液传播,与慢性疲劳综合征、慢性EB病毒样感染、幼儿急疹及器官移植病人的并发症相关,在人类免疫缺陷病毒感染者中可引起致命性并发感染。大多数幼儿在3岁前就已感染此病毒并潜伏在外周血单个核细胞中呈终身潜在感染,因此约80%成年人的外周血单个核细胞中有低拷贝数的此型病毒的序列存在。β疱疹病毒除HHV7以外,已经发现并证实的还有巨细胞病毒及人疱疹病毒6A和6B,其基因组具有共线性。其中HHV6和HHV7无论是致病性还是基因组序列,都有较大的相似性,HHV7基因序列与人巨细胞病毒也有一定程度的同源性,因此,HHV7感染的特异性诊断存在许多障碍。HHV7的全基因组序列已有报道[1],对其所编码的蛋白也已进行了分析。近来认为被膜蛋白pp85是HHV7的主要免疫性抗原,具有高度的特异性[2~4]。本研究应用原核表达载体表达pp85蛋白的部分主要抗原决定簇基因,所获融合蛋白为进一步完善HHV7抗体检测奠定基础。 
    1  材料和方法 
    1.1  菌种和质粒 
    宿主菌E.coli BL21和质粒pThioHis A由中国疾病控制中心性病艾滋病中心病毒免疫室邵一鸣教授惠赠。 
    1.2  PCR引物设计 
    应用DNAstar软件设计扩增HHV7 ORF U14基因编码C末端328~533氨基酸区段的特异性引物[5],并在上下游引物的5′端分别引入SalⅠ和KpnⅠ酶切位点和保护性碱基,两条引物的序列分别为:上游引物5′CGGTACCTTGTATTTTGCCTTCTTTTG3′,下游引物5′GCGTCGACGGGGATGTTCTATTCTC3′,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,扩增产物为633 bp。 
    1.3  PCR目的基因的制备 
    收集健康携带者唾液3 mL,蛋白酶K裂解,酚氯仿异戊醇法常规提取DNA。以提取的唾液DNA为模板,反应体系25 μL,包括10×buffer 2.5 μL,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,上下游引物各0.3 mmol/L,Taq 1 U,模板2 μL。反应条件为:94  ℃预变性5 min;然后94 ℃ 60 s,55 ℃ 60 s,72 ℃ 90 s,35个循环;最后72 ℃延伸10 min。PCR产物于含溴化乙锭(0.5 g/L)的12 g/L琼脂糖凝胶中电泳检测。扩增产物连入pMD18T载体,进行序列测定。 
    1.4  pp85原核表达载体的构建 
    用SalⅠ和KpnⅠ分别对PCR产物及载体pThioHis A同时进行双酶切,用QIAGEN试剂盒(德国)回收目的基因片段和载体片段,T4 DNA连接酶进行连接。连接产物转化TSS法敏化的宿主菌E.coli BL21,在ALB(氨苄青霉素浓度100 mg/L)琼脂平板上筛选阳性转化菌,通过质粒小量快提进行筛选鉴定,同时对筛选的质粒用SalⅠ以及KpnⅠ双酶切鉴定重组质粒,阳性克隆由上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。 
    1.5  重组质粒的诱导表达 
    将鉴定出的重组菌用ALB培养基进行培养,200~225 r/min离心,37 ℃培养至吸光度(600 nm)约为0.2时,加入异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG,终浓度为1 mmol/L),37 ℃继续诱导。每隔1 h收集1 mL菌液,离心回收沉淀加50 μL 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)上样缓冲液重悬,100 ℃煮沸5 min,12 000 r/min离心1 min,取上清行120 g/L的SDSPAGE,考马斯亮蓝R250染色,检测重组蛋白的表达。 
    1.6  Western印迹检测重组融合蛋白的特异性 
    将重组融合蛋白、质粒对照及E.coli BL21全细胞蛋白行SDSPAGE电泳,电泳结束后,取出凝胶,Western 印迹法检测重组融合蛋白的特异性。 
    2  结    果 
    2.1  PCR扩增产物 
    琼脂糖凝胶电泳显示PCR扩增产物长度约为633 bp,与DNA标准相对分子质量参照物相比,其大小与预测值一致,电泳结果见图1。 
    2.2  重组质粒的筛选鉴定 
    SalⅠ和KpnⅠ双酶切后,琼脂糖电泳显示有4.4 kb和633 kb两条带(图1),与理论计算的质粒载体片段、目的基因片段的分子大小一致,说明克隆成功。 
    2.3  目的基因的序列鉴定 
    pMD18T载体测序结果与HHV7标准株序列与基本一致;阳性克隆测序结果显示目的基因正确插入到表达载体中。 
    2.4  重组蛋白的SDSPAGE分析 
    含重组质粒的诱导菌在相对分子质量3.57万处可观察到一条明显蛋白条带,而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的蛋白条带要弱得多,作为对照的pThioHis A诱导菌在相对分子质量3.57万位置未观察到蛋白条带。计算机对目的基因表达的多肽相对分子质量估计为2.29万,加上质粒对照表达的多肽相对分子质量1.28万,合计3.57万与理论预测值相一致。观察诱导不同时间的蛋白带型,诱导4 h的融合蛋白表达量最高(图2)。 
    2.5  Western印迹检测重组融合蛋白的特异性 
    Western印迹实验结果显示,融合蛋白可识别HHV7特异性抗体,表明pp85蛋白诱导表达成功(图3)。
 3  讨    论 
    人群中HHV7感染极为普遍,而且一般为潜伏性感染,通常不表现出临床症状,因此早期诊断活动性HHV7感染并与其他疱疹病毒感染进行鉴别是目前该领域的研究热点。病毒分离是明确诊断HHV7感染的“金”标准,此外应用免疫荧光检测血清中特异性病毒抗体,PCR技术检测临床标本中DNA,也可明确HHV7感染。由于病毒分离耗时较长,需要特殊的设备和技术要求,难以在临床实验室推广应用。PCR法敏感性极高,但不能区分潜伏或活动性感染,易出现假阳性,临床应用受到限制。而ELISA法适于临床及一般实验室应用,HHV7特异性IgG效价检测和IgM检测是区分活动性感染最为常用的指标。由于HHV7基因与其他β疱疹病毒存在抗原交叉,因此采用全病毒蛋白成分作为抗原进行血清学检测的敏感性、稳定性和特异性均存在较多问题,且该类试剂的价格较贵。近年来,有学者对HHV7被膜蛋白pp85进行表达,产生的融合蛋白具有良好的抗原性,使检测敏感性和特异性显著提高[5]。因此,利用基因工程手段获得定性明确的抗原性病毒蛋白进行病毒特异性抗体检测是今后临床诊断多种病毒感染的必然趋势。  

    图1  目的基因PCR扩增产物及重组质粒的酶切鉴定 
    图2  HHV7U14基因原核表达产物 
    图3  重组表达蛋白HHV7 pp85的Western印迹分析结果 
    第①泳道为诱导4 h的重组质粒,可观察到明显的反应条带;第②泳道为蛋白Marker;第③、④泳道分别为未诱导的重组质粒和诱导的质粒对照HHV7被膜蛋白pp85由ORF U14编码,位于基因组19 885~21 831碱基位置。pp85系由648个氨基酸组成的磷蛋白,是HHV7被膜的成分之一,而且具有与其他疱疹病毒被膜蛋白(如HHV6 p100,HCMV pp150和pp65)相同的特征。研究表明,HHV7的免疫优势蛋白是pp85,HHV7单克隆抗体主要与HHV7感染细胞相对分子质量为85 000~89 000蛋白发生反应[3,4]。STEFAN等[6]用免疫印迹技术检测13份与HHV7感染细胞相对分子质量85 000~89 000蛋白发生反应的阳性血清,其中12份可与pp85(U14)重组蛋白反应,只有8份与p86(U11)反应,提示pp85重组蛋白可用于HHV7感染诊断试剂的研制。重组pp85(U14)和p86(U11)蛋白缺乏翻译后修饰,但是不影响其与人血清反应。重组诊断试剂,特别利用细菌表达的融合蛋白,有易于生产、纯化以及标准化等优点。研究证实,ORF U14存在于HHV7和HHV6基因组中,而且其N端约2/3在HHV6和HHV7间具有59.5%一致性。pp85(U14)重组蛋白是HHV7特异性诊断试剂的原因在于:感染HHV7病人的免疫应答主要针对U14蛋白,而感染HHV6的病人免疫应答则主要针对U11蛋白[7]。因为,pp85抗体主要是针对HHV7感染形成的,所以pp85可特异地区分HHV6和HHV7感染。单克隆抗体MAb5E1是HHV7 pp85的特异性抗体,MAb5E1所识别的pp85(U14)的特异性表位已经确定[5],该表位位于pp85蛋白C端484~502氨基酸位置,代表一种HHV7特异的试剂。然而,有研究显示,人血清与该多肽反应水平低,因此以该多肽为基础制作HHV7特异性ELISA尚存有争议。而本研究选择包括编码C端484~502氨基酸在内的核苷酸序列(328~533氨基酸)为目的基因进行原核表达,以便提高此多肽的免疫原性。本研究采用PCR方法扩增HHV7 ORF U14编码C末端具有HHV7特异性表位的基因,扩增产物与质粒pThioHis A经SalⅠ和KpnⅠ酶切后回收并连接,然后转化受体菌E.coli BL21,将筛选鉴定出的重组质粒用IPTG诱导后可表达HHV7 pp85部分蛋白,并经Western印迹证实pp85表达成功,为进一步制备和组装基因工程抗原ELISA试剂盒奠定了基础。pp85蛋白作为HHV7的免疫优势抗原,在HHV7活动性感染的早期诊断、疫苗研究和免疫治疗等方面有广阔的应用前景。 
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