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lican8341的博客

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日志

 
 

Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴定  

2014-12-20 22:13:49|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的 用Grp78基因转染人肝细胞癌SMMC-7721,筛选阳性克隆并鉴定。方法 利用真核表达载体pcDNA3.1+Grp78转染SMMC-7721,pcDNA3.1+Grp78与转染试剂的比例(μg/μL)分别为2∶3、2∶4、2∶5、2∶6、2∶7、2∶8、2∶9, 400 μg/mL G418筛选阳性克隆后,传代扩增,Western Blot鉴定克隆的Grp78表达情况。应用pcDNA3.1空载体作为阴性对照。结果 Western Blot显示,转染后的SMMC-7721经G418筛选,除一个克隆不高表达外,其余克隆均高表达Grp78。结论 Grp78转染SMMC-7721的最佳转染效率是8∶2(转染试剂/DNA),由于假阳性克隆的存在,筛选后的克隆需要鉴定。

【关键词】  Grp78;基因转染;克隆筛选

 Selecting and Verifying SMMC-7721 Clones Transfected by Grp78 GeneGU Yanjiao1, GAO Zhian1 ,SU Rongjian2

    (1.The Pathology Department of the First Affiliated Hospital of Liaoning Medical University;

    2.Central Laboratory of Liaoning Medical University, Jinzhou 121001 China)Abstract:Objective   This paper is to transfect Grp78 gene to SMMC-7721, select high Grp78 expression clone, and verify. Methods  Using pcDNA3.1+Grp78 to transfect human hapatocellular carcinoma SMMC-7721, pcDNA3.1 as control,  DNA: Fugene HD (μg/μL) is 2∶3, 2∶4, 2∶5,2∶6,2∶7,2∶8,2∶9 and selecting positive clones by G418(400 μg/mL), amplifying, then verifying them by WB. Results   Western Blot indicates that SMMC-7721 transfected by Grp78 gene could high express Grp78.  Conclusions  The optimized transfection efficiency of Grp78 transfecting SMMC-7721 is 8∶2(Fugene HD/DNA), as the existence of false positive clones, we need to verify all clones before using them.

    Key words: Grp78; gene transfection; clone selecting

    Grp78(葡萄糖调节蛋白78)是内质网合成和分泌的一种多功能蛋白质,它是热休克蛋白70家族(HSP70)的一员。在细胞的分化、生存、应激反应、血管的形成、肿瘤的发生等方面都发挥着重要的作用[1-3]。最近研究发现,下调其表达可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移能力[4]。为进一步研究Grp78在肝细胞癌侵袭和转移方面的作用,我们用Grp78的真核表达载体转染SMMC-7721,筛选高表达克隆,鉴定。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    人肝细胞癌SMMC-7721,购至于中科院细胞库。转染试剂 (Fugene HD)和G418购至于沈阳联星。Grp78抗体,购至Santa Cruz。

    1.2  细胞培养

    用含10% 胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的DMEM培养基培养。每3天换1次液,细胞80%融合后传代,用含0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液消化细胞。

    1.3  人Grp78基因表达载体的构建

    2007年,已经成功地构建完成[5]。

    1.4  SMMC-7721细胞G418最小致死剂量筛选

    用96孔板接种SMMC-7721,细胞密度80%,贴壁24 h后,加入含G418分别为100、200、300、400、500、600、700、800 μg/mL的浓度。每3、4天换液1次,观察时间由细胞的死亡程度决定(一般1个月)。筛选致死SMMC-7721的最少剂量作为以后筛选克隆细胞使用。

    1.5  pcDNA3.1+Grp78转染SMMC-7721

    选取30代以内的细胞做转染。

    1.5.1  SMMC-7721接种于6孔板(或平皿),细胞密度70%左右,每孔2 mL完全培养液(无抗生素);

    1.5.2  配制转染试剂:按照每孔2 μg DNA/100μL DMEM配制DNA稀释液,加入EP管。分别按照DNA与转染试剂(μg/μL)体积比3∶2,5∶2,8∶2将Fugene HD垂直加入EP管中,混合均匀,室温静置30 min,对照组转染空载体pcDNA 3.1;

    1.5.3  细胞贴壁24 h后转染,不用更换培养液,直接垂直加入配好的转染试剂(3∶2,4∶2,5∶2,6∶2,7∶2,8∶2,9∶2);

    谷燕娇,等:Grp78基因转染肝细胞癌SMMC-7721克隆筛选及鉴定辽宁医学院学报  2008年10月,29(5)1.5.4  加入转染试剂后,混合均匀,放入培养箱中培养。

    1.6  G418筛选

    24~48 h后,首次换液,加入G418的最小致死剂量。之后每3、4天换液,加G418。注意防止污染。直到形成单个克隆。

    1.7  克隆培养

    G418筛选后的克隆细胞,分别挑空载体pcDNA3.1和pcDNA3.1+Grp78至96孔板中,继续加入最小致死剂量的G418培养。标记好克隆的编号,待克隆细胞长满96孔板后,传至24孔板,待其再长满传至6孔板和25 cm2培养瓶中,之后加入半量G418最小致死剂量培养克隆细胞。

 1.8  克隆鉴定

    克隆细胞的鉴定,通过WB方法鉴定。分别将转染pcDNA3.1和pcDNA3.1+Grp78的克隆编号后,用细胞刮刀刮下,收集至EP管内。用TBS漂洗后加入RIPA缓冲液(1%NP 40,0.5% 脱氧胆酸钠,1%SDS,0.1%PMSF)裂解细胞,考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。加热变性,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜,5% 脱脂奶粉封闭过夜,加入1∶1 000倍稀释的一抗Grp78,杂交2 h,β-actin作为内参。TBST洗膜后加入二抗温育1 h,TBST洗膜后进行BCIP/NBT显色,采用Chemi-genius凝胶成像系统分析目的蛋白的表达量。

    2  结    果

    2.1  形态学观察

    每天观察G148不同浓度的SMMC-7721死亡情况,确定400 μg/mL是最佳的浓度。如图1所见,可见转染后的细胞的克隆。

    2.2  克隆细胞计数1.转染pcDNA3.1+Grp78的克隆;2.转染pcDNA3.1的图片,40倍;3.转染pcDNA3.1+Grp78的克隆,100倍

    图1  转染后克隆形成图片

    由表1可见,转染试剂与转染质粒的比例以8∶2最好。表1  克隆形成的个数与HD/转染DNA(μg/μL)之间的关系HD∶DNA3∶24∶25∶26∶27∶28∶29∶2克隆形成数10111620253022

    2.3  Westren Blot鉴定

    如图2所示,高表达Grp78细胞克隆的Grp78表达量几乎是SMMC-7721细胞Grp78表达量的三、四倍。由图3可见,转染空载体的克隆细胞与SMMC-7721的Grp78表达情况相近,均比Grp78转染后的克隆表达Grp78水平低。上图为beta-actin结果,下图为7个克隆与SMMC-7721的Grp78表达情况

    3  讨    论

    基因转染技术是将纯化的含有靶基因的质粒DNA或RNA送入细胞内,并在细胞内表达。它包括瞬时转染和稳定转染两种。常用的基因转染技术是将外源基因导入靶细胞,需要一定的载体和导入方法,用于转染的质粒DNA必须无蛋白质,无RNA和其他化学物质的污染,OD260/280比值应在1.8以上。

    本试验用pcDNA3.1做载体,转染Grp78基因进入人肝细胞癌SMMC-7721细胞株,48 h后用G418筛选阳性克隆细胞。结果显示,我们选用的pcDNA3.1+Grp78转染效果很好,通过观察形成克隆个数的多少,认为最佳的转染比例为8∶2,即8 μL转染试剂:2 μg DNA。细胞转染的效率的多少与转染试剂和转染DNA的比例有关,一般按照2 μg DNA与转染试剂3、4、5、6、7、8、9μL作为初步试验,如果转染后的克隆数比较少,可以进一步增加转染试剂以得到更多的克隆细胞。转染试剂对细胞是有一定的毒性的,根据细胞的差异而不同。故而,也不是转染试剂越多转染的细胞率越高,比例合适的转染效率才是最好的。

    鉴定转染基因进入细胞的鉴定,我们应用Western Blot技术(蛋白印迹技术),因为Grp78转染进入细胞后在蛋白质表达上,理论上会高表达Grp78。转染成功的SMMC-7721一定高表达Grp78蛋白,相反,转染失败的克隆,一定不会高表达Grp78,弃掉。然而,由于在细胞株中,有一些自然抗G418的细胞,在400 μg/mL的G418作用下,这样的细胞也会存留下来,因而,在挑克隆的时候,一定要注意挑单个的克隆,不要混杂周围的不明细胞,确保它们是来自于一个细胞的克隆细胞群。这样在用Western Blot鉴定细胞的时候,就保证了细胞的纯度。当鉴定结果为高表达Grp78的SMMC-7721时,可以认为它们是高表达的,当鉴定结果为非高表达的Grp78的SMMC-7721时,可以认为它们只是具备抗G418特性的克隆,而不是我们需要的阳性克隆。一般筛选细胞克隆都需要筛选10个以上,以备有的克隆株突然丢失了转染的基因片断而影响到下一步的试验。因而,我们需要鉴定并冻存阳性克隆细胞。

    在以后使用复苏的高表达Grp78的SMMC-7721时,都需要加入半量的G418作为维持剂量,以抑制少量的非高表达Grp78的细胞生长超过高表达Grp78的克隆细胞。

    综上所述,pcDNA3.1+Grp78转染人肝细胞癌SMMC-7721的最佳的转染比例是8∶2(μL/μg),获得了高表达Grp78的细胞株。经Western Blot鉴定,除一个克隆未高表达Grp78外,其余克隆均是高表达Grp78克隆。

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