注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

TDG蛋白的表达纯化及多克隆抗体的制备  

2014-12-20 22:17:56|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

【摘要】  目的:表达纯化胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)蛋白并制备TDG多克隆抗体。方法:PCR扩增小鼠TDG(mTDG)的基因片段并插入pET28a(+)原核表达载体,表达并纯化HismTDG融合蛋白。用纯化的HismTDG蛋白免疫兔子产生抗血清,进一步亲和纯化抗血清制备抗TDG的多克隆抗体,并检测分析制备的抗体在Western blotting和免疫荧光分析中的应用。结果:在低温(20 ℃)和低IPTG浓度(0.2 mmol·L-1)时,HismTDG融合蛋白大部分在可溶上清部分,用亲和层析法分离纯化了HismTDG蛋白,并用纯化的蛋白制备了兔抗TDG抗体,结果显示制备的抗体能够特异性地在免疫分析中使用。结论:本研究纯化了条带单一的并且具有生物学活性的TDG融合蛋白,制备了具有良好特异性的兔抗TDG抗体,为进一步研究TDG的性质、结构和功能奠定了基础。

【关键词】  胸腺嘧啶糖苷酶; 原核表达; 纯化; 多克隆抗体

  [Abstract] Objective: To express and purify TDG protein, and to prepare the rabbit antibody against thymine DNA glycosylase(TDG) protein. Methods: Mouse TDG(mTDG) was amplified by PCR and then was inserted into the fusion expression vector pET28a(+). After being expressed in E. coli BL21, the HismTDG protein was purified and used to immunize rabbit.Purified antibody was obtained through affinity chromatography column,and its applications were evaluated through Western blotting and immunofluorescence analysis.Results: HismTDG fusion protein was almost all soluble at low temperature(20 ℃) and low IPTG condition(0.2 mmol·L-1). The fusion protein was purified and used to immunize rabbits, the antibody against TDG was obtained. The further results showed that the antibody had a good specificity in immunoassays. Conclusion: We have purified mTDG fusion protein with an obviously homogeneous band and high biology activity and prepared the rabbit antibody against TDG successfully, which lays the foundation for further study on its character, structure and function.

  [Key words] thymine DNA glycosylase; prokaryotic expression; purification; polyclonal antibody

  DNA甲基化联系着基因沉默,是重要的基因转录调控方式和常见的DNA复制后修饰形式,在生长调控和分化中扮演了重要作用[1]。然而,胞嘧啶甲基化也是基因组不稳定的一个根源[2],因为DNA脱甲基化是通过脱氨基途径先形成G ∶T错配,然后修复G ∶T错配进行[3]。甲基化胞嘧啶自发水解脱氨基形成的错配是基因组内源最常见的突变原因之一[4-5],而基因组的突变往往导致各种癌症等疾病[6-7]。幸运的是,所有生物都进化出了修复G ∶T错配的酶,胸腺嘧啶糖苷酶(TDG)是一个修复G ∶T错配的重要蛋白酶[8]。人源TDG蛋白包含410个氨基酸,小鼠的含421个氨基酸,然而,TDG蛋白在SDSPAGE中的条带位置大约在60 kD[9]。TDG不仅和SUMO1和SUMO3相互作用,而且能够被它们共价修饰[10-12],SUMO化修饰影响了TDG的结构和酶活特征,是TDG发生错配修复过程中所必需的生物学事件[13],HeLa细胞样品的Western blotting结果显示,TDG有两条带:一条是TDG条带,大约60 kD,一条是TDGSUMO条带,大约86 kD[13]。另外,研究报道,TDG定位在细胞核内[10,14]。

  为了开展对TDG的研究,我们自己表达并纯化了鼠源的TDG蛋白,并用纯化的蛋白免疫兔子制备了高滴度的多克隆抗血清,进一步亲和纯化抗血清,获得了高质量的antiTDG多克隆抗体,制备的抗体能够在Western blotting实验中有效地识别细胞及动物组织样品,而且在免疫荧光分析中能够很好地使用。

  1 材料和方法

  1.1 材料

  1.1.1 实验动物 3个月左右健康的新西兰大白兔购自南京农业大学动物中心。

  1.1.2 菌株与载体 大肠杆菌克隆菌株Top10和表达菌株BL21(DE3)由本实验室保存;原核表达载体pET28a(+)购自Novagen公司;pCIHAmTDG由实验室构建。

  1.1.3 试剂 逆转录试剂盒、限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ、高保真Pyrobest DNA 聚合酶,T4连接酶购自TaKaRa公司;IPTG购自上海生工生物工程技术服务有限公司;DNA回收试剂盒购自上海博彩生物公司;镍(Ni+)亲和介质及Sephadex G15购自Pharmacia公司;Lipofectamine 2000 转染试剂购自Invitrogen公司。其它化学试剂均为分析纯,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

  1.2 方法

  1.2.1 原核表达质粒的构建 合成构建pET28amTDG需要的PCR引物。TDGNdeⅠ: 5′ggaattccatatggac

  gcagaggccgcgcgca3′;TDGXhoⅠ: 5′ccgctcgagagcgtggc

  tctcttcttcctg3′(画线部分分别为NdeⅠ和XhoⅠ位点)。通过PCR扩增方法用高保真Pyrobest DNA 聚合酶从小鼠cDNA上扩增TDG基因片段,经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,琼脂糖凝胶电泳分离并回收TDG基因片段后,插入NdeⅠ和XhoⅠ酶切回收的pET28a(+)载体,对重组表达质粒进行NdeⅠ、XhoⅠ酶切鉴定和DNA测序,分析其阅读框和编码序列的正确性。

  1.2.2 HismTDG蛋白的表达与纯化 构建好的pET28amTDG被转入表达宿主菌 E.coli BL21(DE3),挑单克隆到含60 μg·ml-1卡那霉素的LB液体培养基过夜活化,然后按1∶100的比例转接入1 L含60 μg·ml-1卡那霉素的LB液体培养基中,37 ℃ 3 h左右到OD600=0.7~0.9时,将LB冷却到20 ℃,然后加入IPTG到终浓度为0.2 mmol·L-1,16 h后收集菌液,用40 ml TrisHCl缓冲液(50 mmol·L-1 TrisHCl,pH 8.0,150 mmol·L-1 NaCl, 1 mmol·L-1 PMSF)重悬菌体,超声裂解20 min(脉冲5 s,间隔10 s),13 500×g离心15 min。将收集的上清以0.5 ml·min-1的速率加载到TrisHCl缓冲液预平衡的Ni+亲和柱,上样完毕后用TrisHCl缓冲液充分洗涤至基线,再分别用含有10 mmol·L-1和50 mmol·L-1咪唑的缓冲液洗涤杂蛋白,最后用含250 mmol·L-1 咪唑的缓冲液洗脱目的蛋白。通过Ni+亲和柱纯化的洗脱蛋白立即使用Sephadex G15 凝胶柱层析去除咪唑。纯化后的蛋白加入10%的甘油后,保存在-80 ℃。

  1.2.3 TDG的活性分析 TDG的活性分析参照文献[15]进行,T44(5′aattgggctcctcgaggaattTgccttctgcaggca

  tgccccgg3′)在5′端用[γ32P]ATP标记,然后与G44(5′ccggggcatgcctgcagaaggcGaattcctcgaggagcccaatt3′)退火形成异源双链,即测活反应的DNA底物。测活反应体系为:50 mmol·L-1TrisHCl(pH 8.0),1 mmol·L-1DTT,50 μg·ml-1BSA,1 mmol·L-1EDTA,3%甘油,DNA底物0.3 nmol·L-1和适量的TDG蛋白,10 μl反应体系37 ℃反应30 min,加入1.1 μl 1 mol·L-1的NaOH,90 ℃反应30 min,迅速置冰上,短暂离心后,加入5 μl测活loading(90% formamide, 10 mmol·L-1 EDTA, 0.1% xylene cyanol, 0.1% bromophenol blue)。取10 μl 混合物用14%聚丙烯酰胺测序胶分离,Tyhoon 9410 workstation (Amersham)进行扫描与分析。

  1.2.4 多克隆抗血清的制备与纯化 先取2~3 ml兔子血液作为免疫前阴性对照,用完全弗氏佐剂乳化500 μg纯化的TDG蛋白后,皮下多点注射在兔子的背部和颈部,2周后加强免疫,用不完全弗氏佐剂乳化蛋白。以后每间隔2周加强免疫1次,在加强免疫3次后,用纯化的蛋白做ELISA检测抗体的效价,结果显示1只兔子效价很好,滴度大约为214,另1只的滴度不太好,大约为29。颈部采血处死兔子,收集血清。

  先用IgG binding缓冲液(10 mmol·L-1 TrisHCl, pH 7.5)平衡Protein A柱子,效价较高(214)兔子的血清样品上柱后吸附10 min,然后用2~3倍体积的binding 缓冲液洗去杂蛋白,再用洗脱缓冲液(0.1 mol·L-1 glycine buffer, pH 2~3)洗脱,洗脱下来的IgG用1.0 mol·L-1 Tris(pH 7.5)中和。产生的多克隆抗体加入0.02%的叠氮钠和20%甘油后,保存于-80 ℃。

  1.2.5 细胞培养和转染 小鼠黑色素瘤细胞B16F10和人胚胎肾细胞293T购自American Type Cell Culture(ATCC),用含有10%小牛血清的Dulbeccos modified Eagles medium(DMEM)培养。对于Western blotting分析,细胞用磷酸钙转染方法;对于免疫荧光分析,细胞用lipofectamine 2000转染试剂转染。

  1.2.6 Western blotting分析 制备细胞或组织样品,进行10%的SDSPAGE 电泳,然后将蛋白电转到PVDF 膜上,用5%脱脂牛奶包被1 h,再在合适大小杂交袋中,包被一抗室温2 h,10 min 3次洗膜后,包被二抗室温1 h,洗膜后用发光液发光,在暗房中剪取合适大小的X 线片显影和定影。

  1.2.7 免疫荧光分析 B16F10细胞被铺在含有无菌盖玻片的6孔板中,等细胞长到20%~30%时,用pCIHAmTDG转染细胞,转染24 h 后,用4%的多聚甲醛4 ℃ 1 h固定细胞,然后含0.5% Triton X100 的温热PBS室温45 min改变细胞的通透性,再用含3% BSA 的PBS 溶液室温2 h或4 ℃过夜预包被后,用含3% BSA 的PBS 溶液稀释一抗,4 ℃包被过夜。10 min 3次洗涤后,用含3% BSA 的PBS 溶液稀释二抗(1∶250),暗处1 h。洗涤后,用PBS稀释的Hochest(1∶2 000)进行细胞核的染色。5 min后,在载玻片上滴加20 μl甘油,然后将盖玻片倒扣在载玻片上,用荧光显微镜进行观察、拍照。

  2 结 果

  2.1 HismTDG融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定

  通过参考文献[15]及自己摸索条件,我们确定HismTDG在低温20 ℃和低IPTG浓度0.2 mmol·L-1时,能够很好地表达并且大部分在可溶上清(图1A)。用Ni+ 柱亲和纯化,G15分子筛去除咪唑,我们获得了单一条带的HisTDG融合蛋白(图1B),用Bradford法测蛋白浓度,经计算有15 mg·L-1的得率。进一步通过TDG经典的体外测活反应验证本研究表达纯化的蛋白有良好的G ∶T错配修复活性(图2)。

  A: M. 蛋白Marker;Lane 1~3.依次为未经IPTG诱导的总蛋白、上清和沉淀;Lane 4~6.依次为IPTG诱导的总蛋白、上清和沉淀。 B: 纯化的HismTDG蛋白。 C: 纯化的TDG抗体。 D: 从两家公司购买的TDG抗体的Western blotting分析:1. 过表达体系; 2. 内源体系。 E: HA抗体的Western blotting分析,泳道同D。F: 制备的TDG抗体的Western blotting分析:1. 过表达的带有HA tag的HATDG; 2. 小鼠胸腺细胞; 3. MEF细胞; 4. B16F10细胞; 5. 293T细胞; 6. 大鼠胸腺细胞

  2.2 TDG抗体的制备

  我们用纯化的HismTDG融合蛋白免疫了2只新西兰大白兔,在经过4次免疫后,ELISA结果显示其中1只兔子的血清滴度为214,另1只效果较差,仅有29。用Protein A柱子纯化高滴度的兔子血清,得到图1C所示的具有较高纯度的TDG多克隆抗体。IgG H和IgG L分别代表IgG的重链和轻链。

  2.3 TDG抗体在Western blotting中的应用

  我们首先用Western blotting实验鉴定所制备的抗体,图1F结果显示,该抗体能够有效地识别小鼠、大鼠

  以及人源的TDG蛋白,而且无论是内源的TDG,还是细胞过表达的HATDG,该抗体均能够有效地识别。如文献[11]所述,HA抗体的Western blotting结果也显示(图1E),细胞的TDG样品可以压出两条带:一条是TDG条带,另一条是TDGSUMO条带。本研究结果显示,在小鼠样品中,我们的抗体能够有效地识别这两条带,但对于大鼠和人源的样品,没有检测出TDGSUMO条带。

 2.4 TDG抗体在免疫荧光分析中的应用

  进一步用制备的抗体进行免疫荧光检测,图3结果显示,2 μg·ml-1的抗体终浓度能够在免疫荧光实验中很好地识别过表达的HAmTDG,8 μg·ml-1的抗体终浓度能够很好地识别内源的mTDG蛋白。

  3 讨 论

  为了开展对TDG性质、结构和功能的研究,一个高质量的纯化蛋白和高效且特异的TDG抗体是必不可少的,然而当时从能够买到的两家公司购买的TDG抗体均不能在Western blotting实验中有效地识别TDG蛋白(图1D),所以我们只好自己纯化蛋白制备抗体。为便于纯化蛋白,我们将mTDG亚克隆入含有高效原核表达启动子的pET28a(+)载体中,发现HismTDG蛋白在低温(20 ℃)和低IPTG浓度(0.2 mmol·L-1)时,能够很好地表达并且大部分在可溶上清。我们用亲和层析纯化融合蛋白,用分子筛去除咪唑获得了较纯且具有生物学活性的HismTDG融合蛋白,进一步用获得的蛋白免疫兔子制备了高效且特异的TDG多克隆抗体。

  TDG在机体发挥生物学功能时,切除G ∶T错配的胸腺嘧啶T后,自己催化活性中心的151位天冬酰胺能够和对应位置的G形成稳定的氢键,导致TDG紧密结合在DNA链上,不能从链上解离,此时要发生一个TDG 341位赖氨酸(K)的SUMO化共价修饰,改变TDG的构象,在AP内切核酸酶的帮助下使TDG从链上解离下来,进入下游的修复过程[811]。Western blotting结果显示,我们制备的抗体能够很好地识别小鼠源的细胞和组织样品,能够清晰压出TDG和TDGSUMO化修饰条带。而且我们从结果中惊奇地发现,鼠纤维原细胞(MEF)的TDGSUMO化修饰很弱(图1F lane 3),而小鼠胸腺细胞及黑色素瘤B16F10细胞的TDGSUMO化修饰较强,结合TDGSUMO化的作用及功能,我们推测可能是MEF细胞本身不够活跃因而细胞内没有太多的G ∶T错配,从而TDG发挥错配修复的几率较低,进而也就不需要TDG的SUMO化修饰;而胸腺是T细胞发育成熟的场所,细胞增值迅速同时伴随着TCR重排等生物学事件,在这个过程中有频繁的甲基化和脱甲基化发生,从而导致G ∶T错配发生率较高,而肿瘤细胞B16F10增殖迅速且活跃从而可能导致细胞内也有较高的G ∶T错配,因而需要TDG发挥修复G ∶T错配的生物学功能,进而需要它发挥生物学功能所必需的SUMO的发生。

  我们进一步检测了TDG抗体在免疫荧光中的应用,结果表明,低浓度的抗体能够识别过表达的TDG蛋白,高浓度的抗体能够识别内源的TDG蛋白,这说明TDG抗体能够很好地在免疫荧光中使用,并且不同浓度的抗体在免疫荧光中的差别也助于我们研究与TDG相关的细胞定位。

  总之,我们表达纯化了较纯且具有生物学活性的TDG融合蛋白,并且制备了高效而特异的TDG抗体,为开展TDG的研究提供了必要的工具。

  评论这张
 
阅读(100)| 评论(0)
推荐 转载

历史上的今天

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2017