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lican8341的博客

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日志

 
 

CD59特异位点的短肽封条对HeLa细胞凋亡作用的研究  

2014-12-22 20:53:55|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  BrdU 增殖 流式细胞仪 细胞活化

  [Abstract]  AIM: To investigate the correlation of BrdU incorporation with the activation and cytokine expression of T cells. METHODS: PBMCs from healthy persons were isolated and stimulated by PMA plus Ionomycin at different periods of time, BrdU was then added to the cells one hour before the end of culture. The cells were harvested and stained with antiBrdU, anticell surface and intracellular antibodies. Then the cells were washed and analyzed by flow cytometer. RESULTS: The peak of BrdU incorporation was observed in T cells after they were stimulated for 48 hours in vitro, but no further increase of the peak of BrdU incorporation was found after incubated for a longer period of time. The comparison made between BrdU incorporation and cell activation indicated CD69 expression reached the peak after stimulated for 8 hours whereas CD25 was at the peak after stimulated for 24 hours. Furthermore, no correlation between BrdU incorporation and cytokine production was observed. High frequency of IFNγ producing cells was detected after stimulated for 8 hours but no obvious increase was observed for a longer period of time. When PBMC were stimulated with OKT3 plus antiCD28, the percentage of BrdU+ T cells was higher than that stimulated by PMA plus Ionomycin. Similarly, the percentage of BrdU+CD8+ T cells was higher than that of BrdU+CD4+ T cells. CONCLUSION: The percentage of BrdU+ cells can be detected by flow cytometer to evaluate the proliferation of T cells. Only a few T cells proliferate after polyclonal stimulation and BrdU incorporation is dependent on stuimulants and time of stimulation. Therefore, BrdU incorporation is not correlated with activation markers and cytokine production.

  [Keywords]BrdU; proliferation; flow cytometer; cell activation

  通常, 人们都是通过3[H]脱氧胸腺嘧啶苷掺入法或MTT比色法来检测T细胞增殖, 这些方法测定步骤较多, 或敏感性相对较低, 且不能从单个细胞水平评价细胞增殖, 具有一定限制性。与这些方法不同, 脱氧胸腺嘧啶苷的类似物5′溴脱氧尿苷(Bromodeoxyuridine, BrdU)可在细胞合成DNA时替代胸腺嘧啶, 通过固定和破膜, 加入荧光标记的抗BrdU抗体, 利用流式细胞术检测BrdU掺入率, 从而反映细胞增殖水平[1]。因此, BrdU掺入法在检测细胞增殖时, 同时还可以检测表面和胞内分子的表达, 从而实现了在单个细胞水平分析细胞增殖。本研究我们系统地比较了不同刺激条件下T细胞的增殖及其与细胞活化分子和细胞因子表达的关系, 为基础和临床研究提供科学依据。

  1  材料和方法

  1.1  材料  APC标记的抗CD4抗体(APCCD4)、 APCCD8、 PECD3、 APCIFNγ、 APCIL2以及相匹配的对照抗体, 鼠抗人CD28单克隆抗体(mAb)、 鼠抗人CD3 mAb(antiCD3)均购自BD/Pharmingen公司(Becton Dickinson/PharMingen USA); PMA、 Ionomycin、 BrefeldinA(BFA)及PI均为Sigma公司产品, FITC BrdU Flow Kit试剂盒为BD公司产品。RPMI1640培养基干粉购自Gibco公司。流式细胞仪(FACS Calibur)购于美国BD公司。

  1.2  方法

  1.2.1  人外周血单个核细胞(PBMC)的分离  抽取健康人静脉血,肝素抗凝。Hank’s液等体积稀释, 用Ficoll进行密度梯度离心(800 g, 22℃, 20 min), 获取外周血单个核细胞, 充分洗涤后, 用RPMI1640培养液调整PBMC密度为1×109/L。

  1.2.2  淋巴细胞体外刺激培养及BrdU掺入  将PBMC 1×109细胞/L培养于48 孔培养板中, 1 mL/孔, 加入antiCD28 (OKT3)(0.2 mg/L)+antiCD28(1 mg/L)或 PMA(20 μg/L)+Ionomycin(1 mg/L)。培养板置于50 mL/L CO2、 37℃培养箱培养, 分别刺激8、 24、 48和72 h, 培养结束前6 h分别加入10 mg/L Brefeldin A(BFA), 并于培养结束前1 h加入10 mL/L BrdU(终浓度为10 μmol/L), 继续孵育至培养结束, 收集细胞。

  1.2.3  细胞染色  收集细胞后, 首先用染色缓冲液(Staining buffer)洗涤细胞2次, 100 μL染色缓冲液重悬细胞, 之后加入表面染色抗体, 置4℃避光染色25 min, 染色缓冲液洗涤1次, 吸弃上清, 100 μL固定/通透缓冲液(Cytofix/cytoperm)重悬细胞, 室温避光反应20 min, 通透/洗涤液洗涤细胞1次。加入100 μL加强通透液(Cytoperm plus) 4℃避光反应10 min, 通透/洗涤液洗涤细胞1次, 之后再加入100 μL固定/通透缓冲液重悬细胞, 室温再次固定细胞5 min, 通透/洗涤液洗涤细胞1次。每管加入100 μL稀释后的DNase, 置37℃培养箱孵育1 h, 通透/洗涤液洗涤细胞1次。加入50 μL通透/洗涤液稀释后的BrdUFITC抗体以及胞内抗细胞因子抗体, 室温避光反应20 min, 通透/洗涤液再次洗涤细胞1次。200 μL染色缓冲液重悬细胞,流式细胞术(BD Calibur, USA)进行检测, 并用Flow Jo软件分析检测结果。

  1.2.4  PI染色  收集细胞后, PBS洗涤细胞2次, 细胞表面分子按常规染色方法进行, 之后200 μL PBS重悬细胞, 加入10 μL PI, 混匀, 反应10~20 min上机进行检测。

  2  结果

  2.1  刺激时间与BrdU掺入之间的关系  为了确定BrdU开始掺入的时间, 我们利用PMA+Ionomycin刺激PBMC 8、 24、 48和72 h后, 检测不同时间点CD3+T细胞BrdU的掺入率。结果表明(图1), 与未刺激组相比, 刺激细胞8  h时, 未见明显BrdU+T细胞(<2%), 当刺激细胞48 h时, BrdU+T细胞的百分率(9.21%)明显增加, 且与72 h掺入率(10.60%)相比, 没有明显变化。

  图1  PMA+Ionomycin刺激时间与BrdU掺入之间的关系(略)

  Fig 1  Correlation of PMA+Ionomycin stimulation and BrdU incoporation

  2.2  BrdU+T细胞掺入与活化分子表达的关系  由上述不同时间点BrdU掺入率的结果可以看出, 在PMA+Ionomycin刺激的条件下, 48 h后细胞才有明显增殖。为了确定细胞的活化与增殖之间的关系, 我们检测了以上不同时间点活化分子CD69和CD25的表达。由图2可以看出, 未刺激的T细胞基本无CD69的表达, 但刺激8 h后CD69已有明显表达, 且72 h内的表达维持在稳定水平。与CD69的变化趋势有所不同, CD25的表达发生在CD69之后, 细胞刺激后24 h CD25的表达明显增加, 48 h达到峰值, 之后有下降的趋势。而BrdU的掺入在刺激48 h时才有明显的增加, 然后稳定在一定的水平。因此, 细胞活化发生在细胞增殖之前, 二者并不同步。

  图2  BrdU掺入与活化分子表达的关系(略)

  Fig 2  Correlation between BrdU incoporation and expression of activation markers

  2.3  PMA+Ionomycin刺激不同时间后BrdU掺入与细胞因子IFNγ和IL2表达的关系  由上述结果可以看出, 细胞增殖与活化的发生并不一致, 那么细胞增殖与细胞因子的表达是否也存在相似的关系, 因此, 我们又检测了不同时间点BrdU掺入与IFNγ表达的关系。由图3可以看出, PMA+Ionomycin刺激细胞后8 h, 即有大量IFNγ表达,  在之后的各时间点之间IFNγ的表达并无明显改变。相反, 在刺激细胞8 h与24 h时无明显BrdU掺入, 在48 h和72 h时可见有BrdU掺入, 此外, 可见IFNγ单阳性、 IFNγ和BrdU双阳性和BrdU单阳性细胞, 表明细胞增殖与细胞因子表达并不一致。为了进一步明确是否BrdU掺入与其他细胞因子之间也存在着类似的关系, 我们又检测了72 h时BrdU掺入与IL2分泌的关系。所获结果与BrdU掺入和IFNγ的关系相类似。

 图3  PMA+Ionomycin刺激不同时间后BrdU掺入与细胞因子IFNγ和IL2表达的关系(略)

  Fig 3  Correlation between BrdU incoporation and IFNγ/IL2 secretion of cells stimulated with PMA+Ionomycin for different period of time

  2.4  OKT3+antiCD28与PMA+Ionomycin分别刺激后CD4+T细胞与CD8+T细胞BrdU掺入率的比较  为了阐明是否在其他多克隆刺激剂条件下也能获得相同的掺入率, 我们又比较了OKT3+antiCD28与PMA+Ionomycin分别刺激后CD4+T细胞和CD8+T细胞BrdU掺入率的情况, 从图4可以看出, OKT3+antiCD28刺激后, CD4+T细胞和CD8+T细胞BrdU掺入率明显高于PMA+Ionomycin。因此, 不同刺激条件下BrdU掺入率有所不同。为了明确OKT3+antiCD28与PMA+Ionomycin刺激后BrdU掺入率不同的原因, 我们首先采用台盼蓝计数不同刺激时间点活细胞的数目(图5), 结果表明, OKT3+antiCD28刺激后, 随着刺激时间的延长, 活细胞数目呈逐渐上升的趋势。与此相比, PMA+Ionomycin刺激后活细胞数目并无明显上升, 相反, PMA+Ionomycin刺激条件下可见死亡细胞数目的增加(图中未显示)。

  图4  OKT3+antiCD28与PMA+Ionomycin分别刺激后CD4+T细胞与CD8+T细胞BrdU掺入率的比较(略)

  Fig 4  BrdU incoporation of CD4+T cells and CD8+T cells after stimulation with either OKT3+antiCD28 or PMA+Ionomycin

  图5  OKT3+antiCD28与PMA+Ionomycin分别刺激不同时间后台盼蓝计数的比较(略)

  Fig 5  Counting with trypan blue after stimulation with either OKT3+antiCD28 or PMA+Ionomycin for different period of time

  2.5  OKT3+antiCD28与PMA+Ionomycin分别刺激不同时间后CD4+T和CD8+T细胞PI染色的比较  从上述结果可以推测, PMA+Ionomycin刺激条件下可能诱导细胞的凋亡, 因而与OKT3+antiCD28相比, 掺入率减少。从图6可以看出, 在OKT3+antiCD28刺激条件下, CD4+T和CD8+T细胞均无明显的PI阳性细胞。与之相比, PMA+Ionomycin刺激时,  PI+CD4+T和PI+CD8+T细胞均有明显增加, 且随着时间的延长, PI阳性细胞数目呈上升的趋势。因此, 提示PMA+Ionomycin刺激后BrdU掺入率不高的现象可能是由细胞死亡所致。

  图6  OKT3+antiCD28与PMA+Ionomycin分别刺激不同时间后CD4+T和CD8+T细胞PI染色的比较(略)

  Fig 6  Staining with PI on CD4+T cells and CD8+T cells after stimulation with either OKT3+antiCD28 or PMA+Ionomycin for different period of time

  3  讨论
    
  以往检测DNA合成都是依据培养体系中核苷酸的掺入量来检测细胞的增殖, 该方法已应用多年, 具有一定的实际意义, 但需要应用同位素, 而且不能从单个细胞水平评价细胞增殖。我们用FCM检测BrdU的掺入, 在单个细胞水平上观察T细胞分裂增殖的同时探讨了T细胞的增殖与细胞活化分子和细胞因子表达之间的关系。由于DNA双链需要解螺旋后才能与荧光抗体结合, 而强酸(HCI)或高温会导致蛋白降解, 不适合于胞内细胞因子的荧光标记。而利用FCM检测BrdU增殖中在DNA酶使胞内DNA变性的同时,能够保留胞内蛋白的结构和荧光强度, 从而避免了DNA变性条件与胞内及表面标志同时检测的冲突[2]。
    
  一般认为, T细胞分裂之前已发生各种改变, 如细胞因子分泌、 增殖、 凋亡和耐受。文献报道, 活化分子如CD25, CD69, CD71和HLADR的表达率与3[H]脱氧胸腺嘧啶苷掺入无明显关系, 低剂量丝裂原/抗原体外短期刺激PBMC可以诱导T细胞表达活化分子, 但不能诱导细胞增殖[3-5]。我们的结果表明, 体外多克隆刺激细胞8 h后, CD69的表达已经非常明显, 24 h后, CD69的表达达到峰值, 且在72 h内维持在稳定水平[6]。在HIV1病毒感染的病人中, CD69的表达被认为是评价CD3诱导的细胞增殖的信号之一[7]。然而CD69的表达只是细胞活化早期发生的生化改变, 并不一定意味着细胞增殖的发生[8, 9]。且有研究表明, 一部分接受多克隆刺激后表达CD69的细胞发生凋亡[1]。另外, 活化标志CD25的表达与CD69类似, 与细胞增殖之间也没有明确的相关性。因此, 检测细胞活化分子(CD69和CD25)的表达并不能用以反映细胞的增殖和分裂。同样, 细胞因子分泌与BrdU掺入之间亦无明显关系。刺激细胞后8 h内已经有大量IFNγ产生, 然而此时细胞还未发生增殖, 刺激48 h和72 h后, 并非所有细胞因子阳性细胞均有BrdU掺入, BrdU+ T细胞也并非均分泌细胞因子。因此, 细胞因子的表达与DNA合成是前后不同时间发生的变化而不是同时发生。大多细胞因子在刺激后12 h内已经开始分泌, 而DNA合成通常在刺激后24 h才显现出来, 这些早期快速表达细胞因子的细胞为记忆性T细胞[10, 11]。
    
  PMA+Ionomycin刺激后T细胞BrdU掺入率明显低于抗CD3+抗CD28刺激的T细胞是由于PMA+Ionomycin刺激条件下, 发生死亡的细胞明显多于抗CD3+抗CD28刺激条件, 且CD4+T细胞死亡高于CD8+T细胞, 从而造成了掺入率的差异。PMA与离子酶素协同作用可诱导活化T细胞表达FasL, 从而发生凋亡[12]。因此, 细胞增殖率同时受到刺激剂种类、 刺激时间和细胞亚群的影响, 与细胞活化和效应性细胞因子的分泌没有相关性。
    
  总之, 对于深入评价淋巴细胞效应功能, 尤其是从单个细胞水平探讨细胞增殖与活化以及效应性细胞因子的产生的关联性, 对于临床上评价自身免疫病和HIV感染等患者的淋巴细胞功能具有重要意义。

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