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日志

 
 

Magainin-Aurein杂合肽基因的合成与克隆  

2014-12-31 19:15:23|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的:构建抗菌肽Magainin-Aurein杂合肽基因,并将M-A杂合肽基因克隆到载体pUC18上。方法:根据已报道的抗菌肽Magainin-2和Aurein1.2基因的氨基酸序列,推导出其cDNA序列,采用基因片段合成结合PCR扩增的策略,分别获得大量完整的Magainin-2和Aurein1.2基因片段。将两者连接为杂合基因并克隆到载体pUC18上。结果:构建了M-A杂合肽基因重组质粒,经PCR扩增、酶切和DNA测序分析表明,杂合肽基因的DNA序列及阅读框完全正确。结论:pUC18-M-A重组质粒构建成功,为进一步亚克隆到表达载体并进行高效表达打下基础,并为其他抗菌肽杂合肽的制备提供了参考

【关键词】  Magainin-2;Aurein1.2;杂合肽基因;克隆

 本实验采用构建杂合肽基因的策略,将抗菌活性强的Magainin-2基因和抗癌谱广的Aurein1.2基因串联起来,并克隆到载体中,以期为进一步亚克隆到表达载体并表达出具有高活性的既抗菌又抗癌的广谱抗菌肽打下基础。
     
  1 材料和方法
     
  1.1 材料
       
  大肠杆菌Top10为长治医学院生物化学教研室保存,质粒pUC18、T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、dNTP、碱性磷酸酶均购自华美,T4多核苷酸激酶、UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司,限制酶、X-gal、DNA Marker购自TaKaRa公司,IPTG购自Promega,其他试剂均为国产分析纯。基因和引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。   
    
  1.2 方法
      
  1.2.1  基因的设计与合成:根据Genbank中Mag-ainin-2和Aurein1.2的氨基酸序列,选择大肠杆菌偏爱的密码子反推出其全长cDNA序列。人工设计合成4个基因片段,分别称为M1、M2、A1和A2。并在Magainin-2基因5,端引入EcoRⅠ酶切位点和羟胺切割位点,在Aurein1.2基因中引入SalⅠ酶切位点。①基因片段M1:5'CG-GAATTCAACGGCATTGGCAAATTTCTGCATAGCG CGAAAAAATTTGGC3'。②基因片段M2:5'GCT-GTTCATAATTTCGCCCACAAACGCTTTGCCAAATT TTTTCGCGCTATC3'。③基因片段A1:5'GTGCT-GCCGGGCCTGTTTGATATTATTAAAAAAATTGCG 3'。④基因片段A2:5'CCGTCGACT-CAAAAGCTTTCCGCAATTTTTTTAATAATATC3'。   
    
  1.2.2  基因片断的磷酸化、连接:将基因片断M2、A1分别用T4多核苷酸激酶(T4PNK)按照产品说明书进行磷酸化。然后将分别含有20、21对碱基互补序列的基因片段M1和M2、A1和A2,互为底物和引物直接进行PCR扩增,合成完整的Magain-in-2和Aurein1.2基因。PCR反应过程:在20μL的PCR反应体系中,管1加入10×Buffer2μL,4×dNTP(25mmol/L)1μL,片段M1、M2(10μmol/L)各1μL,Taq DNA聚合酶1U;管2加入10×Buffer2μL,4×dNTP(25mmol/L)1μL,片段A1、A2(10μmol/L)各1μL,Taq DNA聚合酶1U;PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃30s,55℃30s,72℃30s,共30个循环,72℃延伸5min。回收PCR产物,在T4DNA连接酶及ATP的作用下将Maga-inin-2和Aurein1.2基因16℃连接12h。
       
  1.2.3  连接产物的回收:将连接液在1.5%的低熔点琼脂糖凝胶中电泳,切下大小约为140bp的连接片段,按UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒说明书进行回收。
       
  1.2.4  重组质粒的构建、转化与筛选:质粒 pUC18、连接片段的EcoRⅠ、SalⅠ限制性消化、质粒的去磷酸化以及与杂合肽基因片段的连接、转化,以上过程均参照《分子克隆实验指南》 [8] 进行。转化的大肠杆菌Top10菌液铺制在含IPTG和X-gal的Amp抗性的LB琼脂平板上37℃培养过夜。利用α-互补原理,通过蓝白斑筛选出重组质粒。 1.2.5  重组质粒的鉴定:采用引物P1和P2(根据载体上序列设计的引物P1:5'TTGTAAAACGACG-GC3',P2:5'TGCAGGTCGACTCAG3')进行PCR扩增初步鉴定重组子,PCR扩增条件:94℃预变性5min,94℃30s,50℃30s,72℃30s,共30个循环,72℃延伸7min。重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ限制性消化后在2%的琼脂糖凝胶电泳检测目的片段;通过序列分析进一步鉴定,DNA序列由上海生工生物工程技术服务有限公司测定。

 2 结果
       
  2.1 杂合肽基因的构建M-A杂合肽基因的构建过程见图1,其在1.5%琼脂糖凝胶中电泳结果见图2,可见连接产物大小约为139bp,与预期相符。
       
  2.2 重组质粒的PCR、酶切及序列分析 质粒pUC18的PCR产物为147bp,而重组质粒pUC18-M-A的PCR产物约为276bp(图3)。重组质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶限制性消化后在2%琼脂糖凝胶中电泳结果如图4,切下的外源目的基因约为129bp。DNA序列分析进一步证明M-A杂合肽基因正确的插入了质粒pUC18中。
       
  3 讨论
       
  抗菌肽是一类小分子多肽,由于其在组织中含量低,分离获得大量的天然产物很困难,而人工合成多肽的成本高 [9] ,限制了其应用前景。因此,利用基因工程大量表达抗菌肽的研究很有意义。
      
  本试验构建了含M-A杂合肽基因的重组质粒。在设计M-A杂合肽氨基酸序列时,以Maga-inin-2的氨基酸作为杂合肽N端,Aurein1.2的氨基酸作为杂合肽C端,中间加上一铰链区转折点(V-L-P) [10] 。并且利用Magainin-2基因的N-端为甘氨酸(G)的特点,在其之前加上一个天冬 酰胺的编码子(AAC),构成羟胺裂解位点(N-G),这样既便于下一步表达重组蛋白时,从融合蛋白中切割所需的目的蛋白,又避免了在基因中加入过多的额外碱基而影响其表达产物的活性。同时在Aurein1.2基因中还设计了终止密码子,同样也避免了利用载体上的终止密码子而产生的在目的蛋白中加入过多额外氨基酸残基的问题,最大限度的减少可能影响表达产物活性的因素。下一步的工作要构建M-A杂合肽基因的重组表达质粒,并在原核细胞中进行融合表达、分离、纯化目的蛋白及进一步的活性检测。

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