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lican8341的博客

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日志

 
 

抗KDR胞内区(KDR-CD)单克隆抗体的制备和鉴定  

2014-12-31 19:26:49|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】    目的: 研制特异性针对肿瘤新生血管内皮细胞生长因子受体(或含激酶插入区受体)胞内区(KDR-CD)的特异性单克隆抗体(mAb)。方法: 以谷胱甘肽转硫酶耦联的KDR-CD(GST-KDR-CD)可溶性融合蛋白免疫BALB/c小鼠, 采用杂交瘤技术制备分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞; 用间接ELISA法测定其亲和力、 亚类, Western blot检测其特异性。结果: 获得1株稳定分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞株, 命名为2B8H2A5; 它分泌的抗体亚类为IgG1, к型轻链, 而且亲和力强、 特异性高。结论: 成功获得能分泌抗KDR-CD mAb杂交瘤细胞, 为以后将该mAb改造成小分子酪氨酸激酶抑制剂, 使其能进入细胞内与受体KDR-CD特异性结合并阻断血管内皮细胞生长因子强大的生物学功能奠定了重要的基础。

【关键词】  血管内皮细胞生长因子 含激酶插入区受体胞内区 单克隆抗体

  目前肿瘤治疗研究过程中, 受到众多学者关注的一种新策略是抑制肿瘤血管的形成。大量研究证实, 血管生成是实体瘤产生、 发展和转移过程中极为关键的步骤。在血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)家族中, VEGF-A在肿瘤血管新生中发挥着重要作用。多种激素、 生长因子和细胞因子都可调节VEGF-A的表达, 低氧[1]被认为是调节VEGF-A表达的主要因素。当实体瘤直径在300 μm以上时, 处于中心的肿瘤细胞变得缺氧; 在乏氧状态下, VEGF-A的表达水平明显上调, 它直接作用于血管内皮细胞(endothelial cells, ECs), 使ECs分裂、 增殖, 促进新血管的形成, 并有效提高血管的通透性。VEGF-A的这些生物学效应主要是通过其特异性受体KDR实现的。KDR 是1992年Terman等[2]最早从人脐静脉内皮细胞(human endothelial vein cells, HUEVC) cDNA文库中, 应用与已知受体酪氨酸激酶的同源产物通过PCR扩增获得, 其相对分子质量(Mr)为200×103~230×103。KDR胞外区与VEGF-A结合后, 导致受体构象改变并发生二聚体化, 进而诱导胞内区的酪氨酸残基自动磷酸化和细胞内信号蛋白的酪氨酸磷酸化, 从而介导VEGF-A完成其重要的生物学功能。研究证明, 靶向敲除编码KDR的基因, 将导致小鼠胚胎第8.5~9.5天死亡, 并出现血岛形成损伤和缺乏成熟的ECs[3]; 在成年小鼠中, 即使是通过药物短期阻断VEGF-A与KDR之间的相互作用, 仍然会引起血管退化[4]。目前国内外都有关于研究抗KDR单克隆抗体(mAb)的报道, 但都是针对KDR胞外区域, 如邵晓枫等[5]制备的抗KDR3 mAb。研究显示, 针对KDR胞外区域的 mAb, 其抑制ECs增殖及血管形成的活性较低。鉴于KDR-CD(a cytoplasmic domain of human kinase insert domain containing receptor)在VEGF-A/KDR信号通路中的重要作用, 我们用杂交瘤技术制备能稳定分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞, 以期获得能抑制VEGF-A生物学效应的抗KDR-CD mAb。

  1  材料和方法

  1.1  材料  BALB/c小鼠(8~10周龄, 体质量18~20 g, 雌性, 清洁级)由四川大学实验动物中心提供; 小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14、 HUEVC, 由四川大学华西基础医学和法医学院免疫学研究室提供; GST纯化蛋白、 GST-KDR-CD融合蛋白(Mr约45×103)由四川辉阳生命工程公司馈赠; 次黄嘌呤H、 氨基喋呤A、 胸腺嘧啶T(HAT), 聚乙二醇购自美国Sigma公司; 辣根过氧化酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自Rocland公司; HRP-STREPTAVIDIN购自北京中山公司; 小鼠的mAb Ig检测试剂盒购自HBT公司; 高Mr marker购自Fermentas公司。

  1.2  方法

  1.2.1  杂交瘤细胞株的建立  用纯化的GST-KDR-CD蛋白作为免疫原, 常规皮下免疫BALB/c小鼠2只, 50 μg/(只·次), 共4次; 末次加强免疫后3 d, 取小鼠脾脏通过机械分离法制成脾细胞悬液, 与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag14在聚乙二醇(PEG)介导下融合, 采用杂交瘤技术建立分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞株。

  1.2.2  mAb的大量制备及纯化  每只BALB/c小鼠腹腔内注射0.5 mL液体石蜡, 7 d后将建株的杂交瘤细胞接种于小鼠腹腔(5×106细胞/只)。10~14 d后收集腹水, 按饱和硫酸铵法进行盐析, G-Sephrose 4B亲和层析纯化, 用紫外分光光度计测定其蛋白浓度。

  1.2.3  mAb的Ig亚类鉴定  按照HBT公司的小鼠mAb亚类检测试剂盒说明书进行。在分别放有不同类及亚类检测试纸条的玻璃管中, 相继加入缓冲液、 待检 mAb及其相应类及亚类的检测抗体, 轻轻振荡试管, 直至检测试纸条上出现斑点。

  1.2.4  mAb的特异性鉴定  采用Western blot法。取预先处理好的样品: 高Mr  marker、 GST蛋白、 GST-KDR-CD蛋白、 HUEVC裂解液, 进行SDS-PAGE电泳分离。电泳完毕, 将凝胶覆盖于NC膜上, 进行转移电泳。转膜完毕, 剪下Marker所在的NC膜, 用氨基黑10B染色。其余NC膜用50 g/L脱脂牛奶封闭, 相继加入抗KDR-CD mAb、  生物素化山羊抗鼠IgG、 HRP-STREPTAVIDIN, 最后做化学发光免疫分析(chemiluminesence immuno, CLIA)。

  1.2.5  KDR-CD的基因序列  KDR-CD的基因序列为5′-TTAAACAGGAGGAGAGCTCAGTGTGGTCCCCGAGTCAGGCTGGAGAA-TCTGGGCTGTGCTACCGGTTTGCACTCCAATCTCTATCAGCTTTAA- AAGTTCTGCTTCCTCACTGGAGTACACGGTGGTGTCTGTGTCATCG-GAGTGATATCCGGACTGGTAGCCGCTTGTCTGGTTTGAGCCTT- CAGATGCCACAGACTCCCTGCTTTTGCTGGGCACCATTCCACC- AAAAGATGGAGATAATTTGGTTCTGTCTTCCAAAGTTTTCAGC- TCTTCTGAGGCAAGAACCATACCACTGTCCGTCTGGTTGTCAT-CTGGGATTACTTTTACTTCTGGTTCTTCTAACGGGATATC-3′。

  2  结果

  2.1  杂交瘤细胞株的建立  融合细胞接种于4块96孔细胞培养板, 融合后7~10 d, 观察到细胞融合率为91.7%(杂交瘤细胞生长孔352孔/接种孔384孔); 初选特异性阳性克隆孔128孔, 阳性率为33.3%(128/384)。经有限稀释法, 对阳性克隆孔进行3次亚克隆, 获得1株能稳定分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞, 该杂交瘤细胞及其分泌的mAb均命名为2B8H2A5。

 2.2  抗KDR-CD mAb的纯化  将杂交瘤细胞2B8H2A5接种于BALB/c小鼠腹腔, 10~14 d后收集腹水(3~5 mL/只)。测定杂交瘤细胞培养上清及纯化抗体的效价分别为2.0×10-4、 1.5×10-6以上, 初步处理纯化抗体浓度6.1 g/ L。

  2.3  mAb的Ig亚类鉴定  用HBT公司提供的Ig检测`试剂盒鉴定2B8H2A5杂交瘤细胞株分泌的mAb, 其亚类为IgG1, 轻链为к型。

  2.4  mAb识别靶抗原的鉴定  Western blot鉴定显示, 2B8H2A5与GST蛋白、 非变性GST-KDR-CD蛋白、 非变性HUEVC裂解物之间没有特异性反应带; 但与变性GST-KDR-CD蛋白、 变性HUEVC裂解物在Mr分别为45×103、 200×103处有明显的特异性反应带(图1)。

  图1  mAb靶抗原的Western blot分析(CLIA法分析样品)(略)

  M: 蛋白marker; 1: 变性GST蛋白; 2: 变性GST-KDR-CD蛋白; 3: 变性HUEVC裂解物; 4: 非变性GST蛋白; 5: 非变性GST-KDR-CD蛋白; 6: 非变性HUEVC裂解物.

  3  讨论
    
  血管新生是指在既已存在的血管基础上, 通过发芽扩增或分支方式形成新的血管。早在1971年, Folkman[6]就提出肿瘤生长与转移离不开血管生成, 无论何种抗肿瘤新生血管形成的技术, 都将是对现有肿瘤治疗学的强有力的补充。要成为抗肿瘤新生血管的靶点, 必须具有良好的特异性, 即选择性表达于与靶向病灶部位相关的血管ECs上, 不仅其功能是血管新生所必需的, 而且使用特异性血管新生抑制剂可阻断其功能。VEGF-A及其受体KDR分别在许多肿瘤细胞、 肿瘤血管ECs中明显上调, 这为抗肿瘤血管新生治疗提供了良好的靶点。Witte等[7]在1993年就发现通过注射抗鼠VEGF-A中和性抗体A.4.6.1可抑制裸鼠皮下移植肿瘤及其血管的生长; 人源化抗VEGF-A mAb Bevacizumab(Avastin)已通过了Ⅰ~Ⅲ期临床试验, 并于2004年被美国FDA批准为转移性直结肠癌的一线治疗药物[8]。
    
  目前有许多观点趋向于采用KDR作为阻断肿瘤血管新生治疗的最佳靶点。理由如下[9]: (1)KDR主要表达于激活ECs, 如肿瘤位点, 针对受体KDR的血管新生抑制剂特异性高; (2)由于肿瘤ECs与血液直接接触, 使KDR受体抑制剂更容易达到靶标; (3)VEGF家族中,  除VEGF-A外, 其他成员如VEGF-C, -D, -E也可作为KDR的配体; 因此, 采用KDR受体抑制剂可潜在阻断它们的刺激作用。现在已确认了位于KDR受体胞内区的几个重要磷酸化位点, 如位于激酶插入区的Tyr951、 Tyr996, 激酶区的Tyr1054、 Tyr1059和胞质内C端的Tyr1175、 Tyr1214。Tyr951(在鼠中是Tyr949)是T细胞特异的配体分子(TSAd)的结合位点, 已证实磷酸化Tyr951/TSAd通路调节ECs迁移[10]; 在小鼠肿瘤模型中, 通过靶向敲除编码TSAd的基因, 小鼠的血管生成减少并且肿瘤的生长受到抑制。Tyr1173(在人中是Tyr1175)发生突变的小鼠, 由于不能形成血管而死于胚胎第8.5~9.5天[11]。
    
  KDR高表达于被激活的血管ECs上, 若能抑制其活性, 阻断VEGF-A/KDR信号转导通路, VEGF-A就不能发挥作用, 从而达到抗肿瘤新生血管形成的目的。为了能最大限度地封闭VEGF-A与内源性KDR受体结合, 我们以GST-KDR-CD蛋白免疫小鼠, 通过杂交瘤技术制备能稳定分泌抗KDR-CD mAb的杂交瘤细胞。在mAb制备过程中, 我们利用间接ELISA法对杂交瘤细胞进行筛选, 每次只选择与GST-KDR-CD蛋白反应呈阳性的克隆细胞进行亚克隆, 分离出针对KDR单一抗原决定簇的B细胞克隆; 这在Western blot检测中得到进一步证明, 我们制备的mAb 2B8H2A5不能识别变性、 非变性的GST蛋白。同时, 由于2B8H2A5能识别变性的GST-KDR-CD蛋白和变性的HUEVC裂解物,  但不能识别非变性的GST-KDR-CD蛋白和非变性的HUEVC裂解物, 提示抗KDR-CD抗体的抗原表位是线性决定簇而不是构象决定簇或新抗原决定簇。实验结果证明, 用GST-KDR-CD蛋白免疫BALB/c小鼠, 通过杂交瘤技术可获得能稳定分泌抗KDR-CD抗体的杂交瘤细胞株。这为以后将抗KDR-CD mAb改造成小分子酪氨酸激酶抑制剂, 使其可利用细胞胞饮形式进入细胞内, 通过相应酶水解作用后, 与内源性KDR-CD结合, 从而阻断VEGF-A/KDR信号转导通路, 抑制VEGF-A在肿瘤血管生成中的重要作用, 并达到抑制肿瘤生长目的等系列工作奠定了重要基础。


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