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日志

 
 

人牙本质涎磷蛋白成熟肽cDNA的克隆、序列分析和原核表达  

2014-12-31 19:47:46|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  基因克隆 
    关键词: 牙本质涎磷蛋白;基因克隆;原核表达  
    摘 要:目的  克隆人牙本质涎磷蛋白(DSPP)成熟肽编码区基因片段并进行原核表达. 方法  用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总RNA,用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头cDNA,然后利用PCR法,从cDNA中扩增出人DSPP成熟肽基因片段(约600bp),将所得基因片段插入pBluescript质粒载体,转化到大肠杆菌XL1-Blue后挑选阳性克隆,提取重组质粒DNA,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆;将DSPP基因重组入表达载体pGEX-3X中构建表达载体,并在大肠杆菌BL21中进行表达. 结果  酶切图谱和序列分析与国外文献报道一致,DSPP蛋白在大肠杆菌中得到表达. 结论  克隆到人DSPP成熟肽编码区基因片段,并在原核中得到表达,为进一步研究其功能奠定基础. 
      
  Keywords:human dentin sailophosphoprotein;gene clone;prokaryotic expression 
      
  Abstract:AIM To clone,sequence and prokaryotic express human dentin sailophosphoprotein(DSPP).METHODS In the study,total RNA was extracted from the tooth germs of a legally aborted embryo by acid guanidinium thiocyanata-phenol-choroform method,the desired DNA product was ob-tained from the total RNA by RT-PCR with the primers in-cluding Oligo(dt)and two gene specific primers.The seg-ment(about600bp)was inserted into pBluescript vector and the interesting plasmid was transformed into E.coli host strain XL1-Blue.The double stranded DNA of the positive clone was analyzed by restriction endonuclease mapping and DNA sequencing.DSPP was then cloned into expression vec-tor pGEX-3X and expressed in E.coli BL21.RESULTS The restriction endonuclease map and sequence of human DSPP encoding mature protein were consistent with those of the references published.DSPP protein was successfully ex-pressed in prokaryocytes.CONCLUSION The human DSPP cDNA encoding mature protein could be obtained and thus have laid a foundation for future function researches. 
      
  0 引言 
      
  牙本质涎磷蛋白(dentin sailophosphoprotein,DSPP)是近年发现的牙本质特异蛋白,其确切功能尚不清楚,可能参与了成牙本质细胞的分化和矿化.目前普遍认为DSPP是成牙本质细胞分化的唯一客观指标,而且DSPP是牙本质发育不全(dentinogenesis imperfecta,DGI)Ⅱ型的重要候选基因[1] .为了深入研究DSPP的生物学功能,分析和探讨成牙本质细胞分化及牙本质形成机制,从基因水平揭示人类牙本质发育不全Ⅱ型的发病机制,用基因工程的方法表达有活性的DSPP蛋白,本实验利用人牙胚组织,根据报道的人DSPP cDNA基因序列设计PCR引物,采用逆转录PCR方法,克隆到DSPP成熟区基因片段,对其进行核苷酸序列分析,并在原核细胞中进行表达. 
      
  1 材料和方法 
      
  1.1 材料  人牙胚的来源和获取:本实验所用人牙胚来源于合法引产人胚胎.无菌条件下暴露牙龈部位,挑开牙龈组织,挖取乳切牙、乳尖牙、乳磨牙,立即置液氮中冻存,-70℃下长期保存.总RNA的提取:磨碎冻存的人牙胚组织,在盛有预冷的变性缓冲液(德国宝灵曼公司)的匀浆器中充分破碎组织细胞,组织与缓冲液的比例为1 10.用异硫氰酸胍一步法从牙胚组织中提取总RNA,并进行电泳鉴定.  
  1.2 方法 
      
  1.2.1 cDNA的合成和PCR扩增  根据报道的人DSPP的cDNA序列,采用PCGene设计PCR扩增的两条引物:5’端引物为GGTGTCCTGGTG-CATGAAGGT,3’端引物为CTTCGTCTTCATC-CTCATCTG,由中国科学院上海细胞生物学研究所基因工程组合成.用Gibco公司的Super Script TM试剂盒,按其说明进行逆转录(RT)合成cDNA第一链,以其为模板,PCR扩增出人DSPP成熟区基因片段(美国MJ Research公司PTC-150型PCR仪).Taq PlusⅡDNA聚合酶购于中科院上海生理研究所生工公司. 
      
  1.2.2 PCR产物的克隆和酶谱分析  PCR产物用大肠杆菌DNA聚合酶ⅠKlenow片段(Premega公司)补平,将载体pBluescriptKS(pBS)用EcoRⅠ酶切,然后用10g L-1 琼脂糖凝胶电泳,在长波紫外灯下切取目的片段和载体,用柱式胶回收试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)回收PCR目的片段和载体pBS,T4 DNA连接酶16℃连接过夜,制备大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞,转化连接产物,蓝白斑筛选阳性克隆pBS-hDSPP.碱裂解法快速提取pBS-hDSPP质粒DNA,用EcoRⅠ单酶切和SalⅠ加PstⅠ双酶切鉴定目的基因是否插入质粒载体中. 
      
  1.2.3 核苷酸序列分析  将酶切鉴定正确的pBS-hDSPP重组质粒再转化XL1-Blue感受态细胞,培养扩增,用T3,T7作引物,利用计算机自动测序仪进行核苷酸序列分析. 
      
  1.2.4 表达载体构建及蛋白质表达  从pBS-hD-SPP重组载体中用BamHI和XholI双酶切切出hD-SPP基因,重组入表达载体pGEX-3X中,构建重组表达载体.重组载体经酶切鉴定证实构建成功.将鉴定正确的重组表达载体和pGEX-3X空载体分别转化大肠杆菌BL21,DH5а,JM109,XL1-Blue等,琼脂糖固体培养板培养16h,挑选菌落接种于含氨苄的LB培养基中培养16h,按1%比例分别转种3mL含氨苄的LB培养基,经37℃振荡培养4h后,IPTG诱导2~4h后,用150g L-1 SDS-PAGE电泳来检测蛋白质表达情况. 
      
  2 结果 
      
  2.1 总RNA  提取的人牙胚总RNA电泳(Fig1), 可见28s,18s和5s三条带,其中28s的带最亮,约为18s带的2倍,表明所获得的总RNA无明显降解. 
      
  图1 略 
      
  2.2 RT┐PCR  牙胚组织总RNA经RT-PCR扩增后,可见大小约600bp的特异扩增产物(Fig2).
 图2 略 
      
  2.3 pBS┐hDSPP克隆的酶谱分析(Fig2)  重组质粒pBS-hDSPP经EcoRⅠ单酶切后有两条带3.39kb和0.18kb;重组质粒pBS-hDSPP经SalⅠ加PstⅠ双酶切后也为两条带,2.96kb的空载体和0.6kb的插入片段.pBS-hDSPP酶切图谱与预期的完全相同.  
  2.4 pBS┐hDSPP的序列分析  DSPP成熟肽编码区基因重组质粒pBS-hDSPP核苷酸的测序结果,可读出的600个碱基序列与Gu等[2] 报道的结果完全相同. 
      
  2.5 pGEX┐3X┐hDSPP在大肠杆菌内的表达  重组菌有一明显的46Mr ×103 左右新生蛋白条带,其中BL21菌株表达量最高,诱导的空载体在26Mr ×103 处出现一条新生蛋白条带,与GST蛋白大小一致(Fig3). 
           
  图3 略 
        
  3 讨论 
      
  牙本质细胞外基质是由成牙本质细胞合成和分泌的,由胶原和非胶原蛋白组成.胶原成分组成矿化的基质,起支架作用,而非胶原蛋白参与了矿化的起动和调节.牙本质磷蛋白(dentin phosphoprotain,DPP)和牙本质涎蛋白(dentin sailoprotain,DSP)为已知的两种牙本质特异性蛋白,分别在1967年和1987年在牙本质基质提取物中发现的[3,4] .DPP占非胶原蛋白的50%,在矿化过程中起着成核作用,能够调节羟基磷灰石晶体的形态、大小、和生长速度,是牙本质稳定的关键调节因子;DSP占牙本质非胶原蛋白的5%左右,其具体功能还不清楚.1997年,MacDougall根据小鼠DSP cDNA序列合成的寡核苷酸简并引物来筛选小鼠磨牙cDNA文库,成功地克隆了同时编 码DSP和DPP的cDNA,发现二者共存于由其命名的DSPP基因的连续开放读框内[5] .这一发现随后在大鼠和人的基因水平获得证实[2,6] . 
     
  人的DSPP全长4187bp,开放读框3759bp,含有5个外显子和4个内含子,与小鼠DSPP高度同源,外显子1~4编码DSP,外显子5编码DSP的C末端和DPP.该蛋白富含天门冬氨酸和丝氨酸,是酸性非常强的蛋白,等电点为3.4,推测Mr 为124.6×103 . 
    DSPP在牙本质形成和矿化过程中起着相当重要的作用,近来研究表明DSPP是人类牙本质发育不全Ⅱ型的重要候选基因,是目前国内外学者研究的热点课题.虽然该基因序列已经报道,但其具体功能尚不清楚.我们根据Gu等[2] 报道的人DSPP序列设计引物,采用RT-PCR法克隆到了人DSPP成熟肽编码区cDNA基因片段,该基因片段位于DSPP基因的第四外显子.在此基础上又构建了DSPP基因的表达载体,并成功地在大肠杆菌中进行了表达,为获得DSPP抗体,研究其功能奠定了基础.  

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