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lican8341的博客

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日志

 
 

含RIZ1 PR结构域融合蛋白的原核表达、提纯与功能分析  

2014-12-31 20:41:01|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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[摘要]目的:表达与提纯RIZ1第1个至第200个氨基酸含PR结构域的活性GST融合蛋白质(GSTPR200融合蛋白)。方法:设计引物以含人RIZ1 cDNA全序列的pRIZ1 RH质粒为模板克隆获得目的基因片段,测序核对后经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切,以正确阅读框架插入相同酶切的pGEX6P3中,经转染与IPTG诱导表达筛选到阳性大肠杆菌克隆并提纯该融合蛋白质。分别采用SDSPAGE蛋白电泳法、质谱分析法及组蛋白甲基化转移酶(HMT)测定法鉴定其性质与功能。结果:获得的纯化融合蛋白质相对分子质量约为47 000,其CPM值明显高于对照组(P<001),且与作用时间呈正相关。结论:所构建的融合蛋白原核表达系统能有效表达活性GSTPR200融合蛋白,可供大量提取作进一步研究。

  [关键词]RIZ1蛋白;PR结构域;表达载体;组蛋白甲基化作用

  RIZ1是功能性筛选能与视网膜母细胞瘤(RB)肿瘤抑制因子相结合的蛋白质时分离出来的基因。已发现由于不同启动子的作用,RIZ1可以表达两种蛋白产物,即氨基端含有PR结构域的全长产物RIZ1(1719个氨基酸),以及除缺少RIZ1氨基末端200个氨基酸(包含PR结构域)外其余序列与RIZ1完全相同的RIZ2[1]。研究表明,RIZ1而非RIZ2具有肿瘤抑制特性。一般来说,RIZ1定位于人染色体1p36,为多种不同类型人癌组织所缺失[2]。许多人类肿瘤,如肝癌、结肠癌、神经母细胞瘤、肺癌、黑素瘤、骨肉瘤的组织中出现RIZ1而非RIZ2表达沉默[35]。我们初步研究也发现,人乳腺癌组织中存在RIZ1 mRNA表达的改变[6]。人癌组织和细胞株中RIZ1错义失活性突变均出现在PR结构域内或其附近[7]。在乳腺癌细胞系、肝癌细胞系中由腺病毒介导的RIZ1表达可以造成细胞G2M期阻滞和(或)细胞凋亡[35]。更重要的是基因敲除鼠若无RIZ1表达而仅有RIZ2表达,则易发生胃癌和B细胞淋巴瘤[7]。通过以上研究可以确定PR结构域与肿瘤的发生有直接联系,因此,目前认为RIZ1抑制肿瘤的作用与其PR结构域有关。为了更好地研究RIZ1 PR结构域的功能与结构,我们采用基因工程技术合成并提纯了RIZ1氨基末端含PR结构域的200个氨基酸的融合蛋白,并初步探讨了其体外功能,现报道如下。

  1  材料与方法

  11  材料pRIZ1 RH质粒由本研究组保存;原核表达载体质粒pGEX6P3购自Amersham Biosciences公司,是一种融合蛋白表达载体,含一个可编码谷胱甘肽S转移酶(GST)的读码框架,其下游有多克隆位点,插入符合相应读码框架的外源基因片段,在IPTG的诱导下可表达出与GST相融合的蛋白质;大肠杆菌CM1061菌株(购自New England Biolabs)、大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株(购自EMD Bioscienses)由本课题研究组保存;Pfu DNA聚合酶等PCR试剂购自Stratagene公司;PCR产物纯化试剂盒(QIAquick PCR Purification Kit)、大量质粒提取试剂盒(QIAGEN Plasmid Maxi Kit)为QIAGEN公司产品;限制性内切酶EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ购自Fermentas公司;T4 DNA连接酶购自New England BioLabs公司; Glutathione Agarose吸附柱购自Sigma公司;人组蛋白 H3购自upstate公司;AdenosylLMethionine,S[methyl3H] 购自PerkinElmer公司;BioRad蛋白测定试剂盒购自BIORAD公司。

  12  PCR引物的设计与合成目的基因为含PR结构区的PR200基因片段,位于RIZ1全基因序列的第1~600个核苷酸(nt1600)。通过GenBank检索RIZ1的cDNA序列,采用DNA Star软件设计PCR引物,上游引物(GSTPR200P1)序列为:5′ACCGAATTCCATGGAAGTGAGGCTTTTCCCTTC3′,含EcoRⅠ酶切位点及启始密码子;下游引物(GSTPR200P2)序列为:5′CTCCTCGAGTCATTATGCAGAG GTGAAATCTGGCT3′,含终止密码子及XhoⅠ酶切位点。引物由Invitrogen公司合成。

  13  目的基因的PCR扩增以 pRIZ1 RH质粒为模板,以GSTPR200 P1、GSTPR200 P2为引物,采用Pfu DNA聚合酶PCR扩增目的基因。阴性对照以等量去离子水代替模板。其反应条件为:95℃ 13min 热启动;95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 60 s,30个循环;最后72℃延伸10min。取PCR产物5μl,DNA Marker 1μl,经2 % 琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下观察结果。产物纯化后经ABI PRISMTM 310 型基因分析仪(PERKIN ELMER) 测序确认。

  14  重组载体的构建

  141  PCR反应产物的纯化  将以上PCR产物点样于2 %的琼脂糖凝胶进行电泳,使用PCR产物纯化试剂盒纯化回收,用20μl去离子水溶解,取1μl在2 %琼脂糖凝胶电泳上检查,纯化成功后-20℃贮存。

  142  载体pGEX6P3的制备  将原核表达载体pGEX6P3转入大肠杆菌CM1061菌株。挑取单个菌落培养,用质粒提取试剂盒大量提取质粒DNA,溶解于50μl的去离子水中。-20℃贮存。

  143  PR200-pGEX6P3原核重组表达载体的构建  将纯化后的PCR 产物和pGEX6P3表达载体同时分别用核酸内切酶EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切, 并分别用PCR产物纯化试剂盒纯化,氯仿抽提法回收。在T4 DNA连接酶作用下,连接含PR 基因片段与表达载体获得了PR200-pGEX6P3重组质粒(5 498 bp)。

  15  表达重组蛋白阳性克隆的检测与鉴定用PR200-pGEX6P3重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株, 涂布含100mg?L-1 AMP 的LB琼脂平板,37℃恒温培养过夜,平板上长出较好菌落。挑取阳性菌落接种在10ml含青霉素抗性的LB 试管中,37℃剧烈振荡培养过夜。次日按1∶60的比例接种过夜,培养物于15ml含青霉素抗性的LB 试管中,于37℃剧烈振荡培养至OD600 nm为05~08,均分该培养物为两部分,一部分加入异丙基β硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mmol?L-1以诱导GSTPR200表达,另一部分不加IPTG作对照,继续培养5 h,每隔1h两部分各取1ml 培养物离心后留沉淀细胞置-70℃冷冻过夜。采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)法,检测与鉴定能够表达与GST融合的含PR结构区蛋白质(GSTPR200融合蛋白)的阳性菌落。

  16  GSTPR200融合蛋白的提纯与质谱分析挑取GSTPR200融合蛋白表达阳性菌落接种在10ml含青霉素抗性的LB 试管中,37℃剧烈振荡培养过夜,次日按1∶60的比例接种于400ml含青霉素抗性的LB 培养瓶中,于37℃剧烈振荡培养至OD600 nm 为05~08,加入IPTG至终浓度为1mmol?L-1以诱导GSTPR200表达,继续培养40~50 h。离心收取细胞,置-70℃冷冻过夜。次日用5ml PBST重新悬浮细胞,于4℃温度下超声破碎细胞,利用Glutathione Agarose吸附柱提纯GSTPR200融合蛋白。通过WatersMicromass LCT质谱系统(Waters公司)分析该蛋白质的分子量。

  17  纯化GSTPR200融合蛋白的组蛋白甲基化转移酶(HMT)活性测定    采用BioRad蛋白测定试剂盒检测纯化的GSTPR200融合蛋白浓度后,按组蛋白HMT测定法分析该蛋白质的活性[8]。反应体系如下:总容积为40μl,含20mmol?L-1 TrisHCl (pH 80),02 mol?L-1 NaCl,04 mmol?L-1 EDTA,1 mmol?L-1 DTT,4 μg 纯化的GSTPR200融合蛋白或GST蛋白(阴性对照),5μg组蛋白H3,3μl (165μCi)AdenosylLMethionine,S[methyl3H]。 各反应混合物于37℃孵育10~20 h 后,分别取5μl(各设3个测定样品,共取15μl)反应物在P81上点样、冲洗、晾干,采用LS 6000IC型液闪仪(BECKMAN公司)测定每分钟脉冲数(CPM)以说明蛋白质HMT活性度。

2  结果

  21  PCR扩增的目的基因PCR扩增产物长度为625 bp,其中目的基因为600 bp,引入扩增产物两端的限制性内切酶识别位点序列、启始密码子与终止密码子识别位点序列及保护碱基长25 bp。同DNA相对分子质量参照物相比,PCR扩增产物的大小与预测的结果一致(图1)。

  图1  PCR 扩增PR200的结果(2 %琼脂糖电泳)(略)

  Fig 1  Amplification of PR200 with PCR (2 % agarose gel)

  1 DNA ladder;2 Negative control;3 PCR product

  22  检出的表达重组蛋白阳性克隆经SDSPAGE蛋白电泳,考马斯亮蓝R250染色观察,包含重组质粒的诱导菌在相对分子质量47 000位置出现一蛋白条带,而未诱导的重组质粒转化菌在相应位置的蛋白条带要弱得多;含质粒pGEX6P3的诱导菌在相对分子质量27 000位置出现一条带。目的基因表达的多肽相对分子质量为19700,与融合蛋白共同表达相对分子质量约为47 000,与理论估计值相一致。见图2。

  图2  IPTG诱导转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达的SDSPAGE 结果(略)

  Fig 2  SDS PAGE showing the IPTGinduced expression of the transformed Ecoli BL21(DE3)cells

  1标准蛋白质;2未诱导的转化pGEX6P3的BL21细胞;3诱导后的转化pGEX6P3的BL21细胞;4、6、8分别为未诱导的三个菌落的转化PR200-pGEX6P3 BL21细胞;5、7、9分别为诱导后的三个菌落的转化PR200-pGEX6P3 BL21细胞。 每泳道加样量约15μg, 12 % 胶。

  1 Standard proteins; 2 Uninduced BL21 cells of pGEX6P3 transformed clone; 3 Induced BL21 cells of pGEX6P3 transformed clone; 4,6,8 Uninduced PR200pGEX6P3 transformed BL21 cells of three clones,respectively; 5,7,9 Induced PR200pGEX6P3 transformed BL21 cells of three clones, respectively 15μg per lane, 12 % gel

  23  GSTPR200融合蛋白的纯化与质谱分析通过Glutathione Agarose吸附柱提纯的GSTPR200融合蛋白经SDSPAGE蛋白电泳,考马斯亮蓝R250染色,在相对分子质量47 000位置呈现单一的蛋白条带(图3)。质谱分析可见46980 处出现单一峰,进一步明确了该纯化融合蛋白质与预期的分子质量一致(图4)。

  图3  GSTPR200融合蛋白纯化的SDSPAGE 结果(略)

  Fig 3  SDSPAGE showing the purification of GSTPR200

  1:标准蛋白质;2:诱导后细胞破碎液;3:通过柱子后的细胞破碎液;4:洗柱液; 5,6:蛋白洗脱液。 每泳道加样量约15μg, 12 % 胶。

  1 Standard proteins;2 Induced lysate;3 Through flow;4 Washing flow;5,6 Elutions 15μg per lane, 12 % gel

  图4  纯化GSTPR200融合蛋白质谱分析结果(略)

  Fig4  Mass spectrometry analysis of the purified GSTPR200

  24  GSTPR200融合蛋白对组蛋白甲基化作用采用HMT测定法可见,GSTPR200融合蛋白组CPM(孵育1、2 h后的3个样本CPM均值分别为817±58、1192±83)明显高于对照组(GST蛋白质组,分别为135±12、184±21), 两者差异具有高度显著性(P<001),且与作用时间呈正相关。

  3  讨论

  PR结构域是肿瘤抑制因子RIZ1的功能区域,本研究为了原核表达与纯化含该结构域的融合蛋白质(GSTPR200融合蛋白),选用了pGEX6P3载体。该载体具有GST 融合特征,可利用此标签进行纯化。采用大肠杆菌BL21(DE3)表达菌的优点在于该菌T7 RNA聚合酶基因可受IPTG诱导表达,而且该菌没有膜结合性蛋白分解酶活性,可抑制表达的融合蛋白质分解。本研究通过将重组载体PR200-pGEX6P3转入BL21(DE3)表达菌,成功地构建了GSTPR200融合蛋白的原核表达系统,并提纯了该融合蛋白质。研究发现PR结域能够使组蛋白H3中的第9赖氨酸甲基化,而人癌组织因PR结构域基因突变造成RIZ1甲基转移酶活性降低[89]。本研究为了了解所获得的GSTPR200融合蛋白是否具有甲基化活性,采用HMT测定法对提纯的融合蛋白质进行了检测。由于组蛋白H3与甲基在HMT的作用下可形成甲基化组蛋白H3,根据这一原理以3H标记甲基([3H]methyl),将其与组蛋白H3及受检测的蛋白一起反应,通过测定CPM可反映形成的甲基化组蛋白H3的量,以说明该蛋白的HMT活性。本研究中纯化的GSTPR200融合蛋白组CPM比对照组(GST蛋白质组)明显增高,表明得到的融合蛋白质中PR部分具有HMT活性。本研究纯化蛋白的大量获取为进一步研究RIZ1 PR区域的结构与功能奠定了基础。

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