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日志

 
 

热休克蛋白70重组腺病毒载体的构建及鉴定  

2014-12-08 22:22:29|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】    目的 构建人热休克蛋白70(HSP70)的腺病毒表达载体,为进一步研究HSP70对应激状态下细胞的保护作用提供实验基础。方法 采用AdEasy系统构建携带外源性HSP70编码基因的重组腺病毒载体pAdHSP70,脂质体法转染人胚肾293细胞,包装产生重组腺病毒vAdvHSP。收获病毒进行滴度鉴定, RTPCR方法检测目的基因在Hela细胞的转录表达。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实HSP70基因正确插入腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中包装出重组腺病毒;荧光显微镜下可观察到GFP的表达,收获病毒的滴度为3.2×1012 U/L。结论 成功构建pAdHSP70重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效转录。  
【关键词】  HSP70热休克蛋白质类 腺病毒科 遗传载体 
  [ABSTRACT] Objective To construct recombinant adenovirus expression vector containning human HSP70 and provide a base for investigating the protection of HSP70 on the cellunder stringent state. Methods The recombinant adenovirus vector pAdHSP70 carrying HSP70 was constructed with AdEasy system and then transfected 293 cells to produce recombinant adenovirus vAdHSP70. The viral titer was tested. The expression of target gene in Hela was tested by RTPCR. Results It was confirmed by PCR, sequencing identification and restrictive analysis that the target gene was cloned correctly to the shuttle plasmid. The expression of GFP could be observed by fluorescence microscope. The viral titer was 3.2×1012 U/L, and RTPCR indicated that HSP70 could effectively express in Hela. Conclusion Recombinant adenovirus vector was constructed successfully and packed in 293 cells. 
     
  [KEY WORDS] HSP70 heatshock proteins; Adenoviridae; Genetic vectors 
     
  热休克蛋白70(HSP70)是一组高度保守的蛋白,作为一种重要的应激蛋白,HSP70可参与应激状态下细胞内蛋白的正确折叠、移位以及降解等,从而维持细胞的正常形态及功能,保证细胞的稳定性。研究结果表明,HSP70在正常情况下表达水平很低或不表达,而在应激状态下细胞内热休克蛋白编码基因被激活,表现为表达上调。本研究旨在将外源性HSP70编码基因插入含GFP标记基因的腺病毒载体中构建重组腺病毒载体,经293细胞包装获得可高效转录表达HSP70的重组腺病毒,为探讨外源性HSP70表达对应激状态下靶细胞的保护作用提供实验基础。 
  1  材料和方法  
  1.1  主要试剂和材料 
     
  逆转录试剂盒购自美国Promega公司,限制性核酸内切酶PacⅠ和PmeⅠ为英国NEB公司产品;DNA Marker、限制性内切酶EcoRⅤ和KpnⅠ、T4 DNA连接酶、pMD18T载体为大连宝生物工程公司产品;TRIzol购自美国Invitrogen公司。携带GFP报告基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV,E1区和E3区缺失的复制缺陷5型腺病毒骨架质粒pAdEasy1,大肠杆菌JM109、BJ5183和 DH10B以及人宫颈癌细胞系Hela和人胚肾293细胞均由青岛大学医学院微生物学教研室提供。 
  1.2  实验方法 
  1.2.1  RNA提取及逆转录合成cDNA  Hela细胞用含体积分数0.10的胎牛血清、105 μg/L 链霉素、105 U/L青霉素的DMEM于37 ℃、体积分数0.05的CO2培养箱内培养。当细胞达80%汇合后,42 ℃水浴30 min,然后迅速放回培养箱中继续培养8 h,胰蛋白酶消化离心收集细胞,采用TRIzol一步法提取细胞总RNA,按照逆转录试剂盒操作说明合成cDNA 。 
  1.2.2  目的基因的PCR扩增及TA克隆  根据GenBank中编码HSP70的核苷酸序列及pAdTrack CMV载体的多克隆位点,采用Primier 5.0软件设计扩增HSP70基因的特异性引物。并分别在两条引物中的5′端引入KpnⅠ和EcoRⅤ酶切位点以及保护性碱基。上游引物序列为:5′CGGGTACCCAACGACGGAGACAGCC3′,下游引物序列为:5′GCGATATCTCCAGCCACGAGATGACC3′,下划线部分为引入的酶切位点。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成,扩增片段长度为1 486 bp。反应体系为:10×buffer 2.5 μL, MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,上下游引物各0.3 mmol/L,Taq 1 U, cDNA 2 μL,无菌去离子水补至25 μL。扩增条件为:94 ℃预变性5 min;然后94 ℃ 1 min,70 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35个循环; 最后72 ℃延伸10 min。取5 μL扩增产物于1 g/L的琼脂糖凝胶(含0.5 mg/L溴化乙锭)中电泳,凝胶自动成像系统分析结果。 
     
  自琼脂糖凝胶中回收纯化目的基因,然后与PMD18T载体在连接酶的作用下进行连接,将连接产物以1×TSS 两步法转化E.coli JM109,涂布于氨卞抗性的LB平板,37 ℃过夜培养。次日挑取平板克隆振荡培养后提取质粒,KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切鉴定筛选阳性克隆,产物送上海生工生物技术有限服务公司测序。 
  1.2.3  穿梭载体pAdTrackCMVHSP70的构建  测序确证序列正确无误后,分别用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切目的基因片段和穿梭载体pAdTrackCMV,并在T4 DNA连接酶作用下以摩尔比1∶3进行连接。将连接产物全部转化已准备好的感受态细菌JM109,取转化菌涂布于含卡那抗性的LB琼脂平板,37 ℃培养14~16 h。然后,从转化菌平板上挑取若干个生长良好的单个菌落接种至5 mL含卡那霉素的LB 培养液中,37 ℃振荡培养16~24 h,取1.5 mL培养液用碱裂解法小量提取质粒。将所提质粒使用限制性内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ进行双酶切电泳鉴定,阳性克隆命名为pAdTrackCMVHSP70。 
  1.2.4  重组腺病毒载体AdHSP70的构建  将pAdTrackCMVHSP70线性化和去磷酸化,随后与腺病毒骨架质粒pAdEasy1在大肠杆菌BJ5183中进行同源重组。自平板挑取较小克隆转入卡那抗性LB培养液中振荡培养16 h,采用碱裂解法小量提取质粒,进行PacⅠ酶切鉴定,鉴定为阳性者命名为pAdHSP70。 
  1.2.5  293细胞包装腺病毒和重组腺病毒滴度测定  QIAGEN质粒纯化试剂盒纯化AdHSP70后,用PacⅠ酶切线性化,脂质体法转染对数生长期的293细胞包装重组腺病毒,同期制备载体对照。用本原正阳公司快速腺病毒感染滴度(TCID50)检测试剂盒测定所获腺病毒滴度,操作按说明书进行,并计算病毒滴度。计算公式:病毒滴度=101+d(s+0.5)×103U/L, d=log10稀释度,s=阳性比率之和。 
  1.2.6  病毒感染靶细胞后RTPCR检测目的基因 取100 μL重组腺病毒液感染Hela细胞,3 d后约90%的细胞观察到绿色荧光时收集细胞, TRIzol一步法提取细胞总RNA,所获RNA加DNaseⅠ消化处理可能污染的DNA,应用RTPCR检测目的基因mRNA的表达。并取5 μL DNaseⅠ消化处理的RNA直接作为模板进行PCR作为对照,以确定是否有DNA污染。PCR产物经10 g/L的琼脂糖凝胶电泳鉴定。 
  2  结果 
  2.1  HSP70编码基因的PCR扩增及pAdTrackCMVHSP70的酶切鉴定 
     
  采用RTPCR自热刺激Hela细胞扩增HSP70编码序列cDNA,可在约1 486 bp处观察到特异性扩增条带,与理论预计值相符且测序后与GenBank报道的HSP70编码序列完全一致。见图1。内切酶KpnⅠ和EcoRⅤ双酶切重组质粒pAdTrackCMVHSP70,电泳后可观察到长约9.2 kb的载体片段和长1 486 bp的目的基因片段,表明目的基因片段成功插入表达载体。 
  2.2  重组腺病毒载体pAdHSP70的鉴定 
       
  重组腺病毒载体pAdHSP70经限制性内切酶PacⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳可观察到长4.5 kb和30 kb左右的两条带,结果提示穿梭质粒pAdTrackCMVHSP70和骨架质粒pAdEasy1的重组发生在ori与右臂之间。见图2。 
  2.3  重组腺病毒的包装 
     
  质粒pAdHSP70经PacⅠ酶切线性化后,用脂质体法转染293细胞,转染48 h后在荧光显微镜下可观察到细胞内的绿色荧光,表明质粒转染成功,外源基因开始表达。之后表达绿色荧光蛋白的细胞数目逐渐增多,转染后5 d达高峰,细胞开始变圆、脱落,第7~9天约90%的细胞表达荧光蛋白时收获细胞,反复冻融3次后离心除去细胞碎片,取上清的1/3继续感染293细胞以扩增病毒,24 h后细胞内开始出现荧光并逐渐增多,说明包装出的重组腺病毒具有感染性且在细胞内不断增殖。重复上述过程3~4次即可获得大量具有稳定感染性的重组腺病毒,所获病毒命名为vAdHSP70,经检测病毒滴度为3.2×1012 U/L。 
  2.4  RTPCR检测 
     
  提取经重组腺病毒感染的Hela细胞总RNA经RTPCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后可明显观察到特异性长为1 486 bp大小的片段,而未感染腺病毒和热应激处理后的Hela细胞此条带相对较弱。见图3。 
  图1  目的基因的RTPCR扩增及重组质粒pAdTrackCMVHSP70的双酶切分析(略)  
     
  ①Marker DL15000;②HSP70 mRNA RTPCR产物;③pAdTrackCMVHSP70 PCR 产物s;④pAdTrackCMVHSP70/KpnⅠ与EcoRⅤ酶切产物;⑤pAdTrackCMVHSP70 
  图2  同源重组质粒的PacⅠ酶切鉴定(略)  
     
  ①Marker DL2000;②AdHSP70 PCR产物;③pAdTrackCMVHSP70/PacⅠ酶切产物;④AdHSP70/PacⅠ酶切产物;⑤AdHSP70;⑥Marker DL15000 
  图3  RTPCR检测Hela细胞中HSP70的表达(略)  
     
  ①Marker DL2000;②vAdHSP70感染Hela细胞;③未感染腺病毒和热应激处理的Hela细胞;④Hela细胞对照 
  3  讨论 
     
  生物体在受到周围环境刺激或不良因素影响时,会产生一系列为适应环境变化而做出的快速细胞代谢调节。在这期间,细胞内某些正常基因的表达受到抑制,而另外一些特殊的基因则被激活,表现为表达上调,其中热休克蛋白就是这类特殊的基因。迄今为止,已发现30余种热休克蛋白,根据同源性和相对分子质量大小,可将其分为HSP70、HSP90、HSP60、小分子HSP以及泛素等[1]。其中HSP70是热休克蛋白家族中含量最多也是最保守的一类。
研究发现,HSP70具有明显增强应激状态下细胞对损害的耐受程度、维持细胞正常功能代谢和提高细胞生存率等作用[2]。DONNELLY等[3]研究结果表明,HSP70在心肌细胞的过量表达是提高心肌对缺血再灌注耐受性的重要途径之一。KINOUCHI等[4]用免疫组化法检测大鼠大脑中动脉阻断后HSP70蛋白的表达,研究结果显示HSP70 蛋白在梗死灶周围神经元,即缺血半影区大量表达。MATSUYAMA等[5]和SAKURAI等[6]将缺血预处理分别用于狗和兔的脊髓缺血性损伤保护作用的实验研究,他们在脊髓缺血前48 h进行缺血预处理,发现脊髓缺血后HSP70的表达增强而且表达时间延长,因而减少随后的脊髓缺血造成的损伤。在这诸多研究中,大多采用热诱导、缺血预处理等方法来诱导内源性HSP70的表达,以证明其保护作用。这种方法简单、直接,但是仍存在一些弊端。因为实验过程中,在对机体给予热刺激或者缺血预处理等的同时,除HSP70基因水平的升高以外,其他基因的表达也会不同程度地受到影响。相对而言,利用分子生物学技术将携带外源性HSP70基因的载体导入特定细胞,使其在细胞内稳定表达,能够更加客观地研究HSP70在应激状态下对靶细胞的保护作用。因此,如何大量获取外源性HSP70基因和选择高效、安全的载体就显得格外重要。 
     
  HSP70普遍存在于所有真核和原核生物体中,但表达量很低。而在机体处于应激状态,包括热应激,化学物质(氧自由基、乙醇等)刺激,缺血低氧,感染以及严重创伤等时表达量明显增加[7~9]。而在这些应激中,热应激是诱导HSP70大量表达的最重要因素。研究报道,虽然肿瘤细胞内HSP70的表达高于正常细胞,但含量仍然较低,将其在热疗等应激条件下处理后HSP70产生明显增多[10]。而对于不同温度诱导引起HSP70表达量的差异,VAN等[11]报道,较激烈的热诱导(43 ℃)作用于肿瘤细胞仅有少量HSP70蛋白表达,而较缓和热诱导(42 ℃),可于诱导后8 h出现且持续高水平表达的HSP70蛋白,激烈的热休克刺激(45 ℃)可导致肿瘤细胞来不及合成HSP70,以致死亡。在本实验中我们从温热休克处理后8 h人宫颈癌细胞系Hela中提取外源性HSP70 mRNA作为模板进行扩增,结果显示扩增后目的基因与理论预计值相符,经测序与GenBank中的序列一致。同时,我们选择了宿主范围广、包装容量大,对人致病性低、滴度高,在增殖和非增殖细胞中均感染和表达基因且与人类基因同源的腺病毒作为载体[12],并通过AdEasy系统与骨架质粒pAdEasy1在大肠杆菌内同源重组而获得重组腺病毒载体[13]。 
     
  本实验成功构建了携带外源性HSP70基因的重组腺病毒表达载体,并在293细胞中包装获得重组腺病毒vAdHSP70,应用RTPCR鉴定结果表明,vAdHSP70重组腺病毒可在靶细胞中高效转录。从而为进一步研究HSP70对应激状态下的细胞保护作用及其在临床治疗和诊断中的应用奠定了实验基础。 
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