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lican8341的博客

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日志

 
 

产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及病毒滴度影响因素  

2014-09-06 22:06:57|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  逆转录病毒载体 
  关键词: 逆转录病毒载体;包装细胞;集落形成单位  
  摘 要:目的  探讨产生重组逆转录病毒包装细胞系建立及其病毒滴度(以cfu表示)的影响因素. 方法  用逆转录病毒载体pSLXCMV,以磷酸钙共沉淀法转染PA317包装细胞,挑选抗性集落(PA317/pSLXCMV)扩大培养后,进行PA317/pSLXCMV细胞接种密度、培养温度(37℃,32℃)、纯化方法等对其培养上清中重组病毒cfu影响的比较性研究. 结果  包装细胞的密度是影响cfu滴度的关键因素;降低培养温度需延长培养时间方可提高cfu滴度;对比离心纯化与过滤纯化,并未发现两者之间的差异. 结论  该实验结果为应用逆转录病毒载体进行的ex vivo基因治疗实验研究提供重要参考指标. 
       
  Keywords:retroviral vector;packaging cell;colony-forming units 
      
  Abstract:AIM To optimize the methods of manufacturing retrovirus containing supernatant of PA317packaging cell line for the use in the retroviral-mediated gene transfer.METHODS Studies were conducted using pSLXCMV retro-viral vector.The colony forming unit(cfu)influence factors including packaging cell density,incubation temperature(32℃and37℃),incubation time and different purification method were compared,respectively.RESULTS Results demonstrated that1.2×106 PA317 packaging cells seeded in100mm plate with the incubation condition at37℃for24hours could get the highest cfu titer of retroviral containing supernatant.As for purification,there was no significant dif-ference between filter and centrifugation methods.CONCLU┐SION These results will be useful for those who use retrovi-ral vector for ex vivo gene therapy experiment. 
      
  0 引言 
      
  在目前众多的基因治疗临床试验方案中,逆转录病毒载体仍是被广泛应用的载体之一[1-4] .作为目的基因转运过程中的逆转录病毒载体和包装细胞,其本身的分子生物学特性已被广泛研究,但对于包装后这些含目的基因的重组逆转录病毒之生物、物理学特性(如病毒对温度的敏感性、纯化方法等的影响)的研究却较少.为此,我们对产生重组逆转录病毒的包装细胞系的建立过程及其上清中重组逆转录病毒集落形成单位(colony forming unit,cfu)影响因素进行了比较性研究. 
      
  1 材料和方法 
      
  1.1 材料  本实验所用表达载体为含有新霉素磷酸转移酶基因(neo)的鼠白血病源性逆转录病毒表达载体pSLXCMV,PA317包装细胞及Swiss小鼠成纤维细胞NIH3T3培养于含100mL?L-1 小牛血清(GIBCO-BRL)的DMEM培养液中.  
  1.2 方法 
      
  1.2.1 逆转录病毒载体包装及包装后cfu滴度测定  以标准的磷酸钙共沉淀法(Promega,Inc.Kit)转染20μg pSLXCMV质粒到PA317细胞14h,换液继续培养24h,换含500mg?L-1 G418(Geneticin)的培养液直至抗G418的集落形成,挑选60个克隆,扩大培养,测定包装细胞上清中病毒的cfu;接种2.5×105 NIH3T3细胞,次日移出培养液,加入10-2 ,10-4 ,10-6 稀释的含重组逆转录病毒的包装细胞上清1mL.4h后加入5mL完全DMEM培养液继续培养18~24h.换含有500mg?L-1 G418培养液继续培养7~10d,直至抗性集落形成.结晶紫染色,计算三个梯度中的cfu(Fig1). 
      
  图1 略 
      
  1.2.2 包装细胞接种密度对其上清中病毒cfu的影响  分别以0.5,0.7,0.9,1.2及1.5×106 不同细胞密度接种产病毒包装细胞,于相同温度及相同培养时间条件下制备含重组逆转录病毒的包装细胞上清,并于相同的条件下测定它们的cfu滴度. 
      
  1.2.3 培养温度及培养时间对cfu滴度的影响  取最高cfu的包装细胞系集落,以相同的密度接种细胞,分别在37℃及32℃的条件下培养细胞,并于24h及48h分别收集细胞上清测定病毒cfu滴度. 
      
  1.2.4 离心及过滤纯化对包装细胞上清中病毒cfu影响  选择高cfu滴度的包装细胞克隆用以制备含重组逆转录病毒的细胞上清,分别用1500g离心10min纯化及Acrylic.45Micron滤器(Corning Inc)纯化,测定cfu,比较它们之间cfu滴度的变化. 
      
  2 结果 
      
  在以pSLXCMV质粒转染的PA317细胞中挑选60个G418抗性细胞集落,并分别于培养1wk和10wk测定cfu.其中4个克隆# 17,# 19,# 28,# 34于1wk的cfu分别为2.8,3.3,1.8,2.2(colonies?L -1 ),而在10wk测得的cfu分别为1.6,2.7,0.9,0.8(colonies?L-1 ). 
     
  接种0.5,0.7,0.9,1.2及1.5×106 转染后包装细胞,24h收集上清测定cfu,结果cfu随细胞密度上升而上升(Fig2).在PA317/pSLXCMV包装细胞密度相同条件下降低温度需延长培养时间,我们在32℃条件下培养48h获得了3.0×109 ?L-1 的cfu滴度. 
    取同一来源的同一份PA317/pSLXCMV包装细胞上清,分别经离心及过滤除去细胞及细胞碎片等,然后以相同的条件测定cfu滴度.结果并未发现明显的差别. 图2 略 
      
  3 讨论 
      
  目的基因导入靶细胞是整个基因治疗过程中一个重要环节,其效率的高低将直接影响整个基因治疗的效果甚至成败,而包装后逆转录病毒滴度的高低是重要参数之一.我们从逆转录病毒载体转染的PA317包装细胞中挑选了60个G418抗性细胞集落,经测定仅有4个集落cfu>106 .经1W至10W传代培养后测定cfu,所有4个在1W cfu很高的细胞集落经10W传代培养后其cfu滴度均有所下降,其中#28及#34的cfu<106,已低于可用限度.上述结果提示在建立稳定产生重组逆转录病毒的包装细胞系时,抗性集落数量的挑选应尽可能多一些并需传代培养观察cfu的变化.制备含重组逆转录病毒的包装细胞上清时,细胞密度及培养温度是影响cfu滴度的重要因素,细胞密度与细胞生长状态有关,过低或过高的细胞密度对细胞生长均不利,均不能使cfu滴度达到最佳化.在100mm培养皿中接种1.2×106 包装细胞可获最佳的效果(Fig2).Runstadler等[5] 曾报道了应用降低培养温度可以增加真核细胞蛋白质的表达.Kotani等于1994年报道了用降低培养温度,并于工业化培养罐中可以增加包装细胞cfu滴度达15倍[6] ,该作者认为虽然32℃并不是细胞的生长条件,但由于细胞本身的代谢减弱增加了单个细胞内的病毒产量,同时温度减低将使病毒失活减少,从而提高了cfu滴度.研究结果中显示37℃培养24h与32℃培养48h之间的cfu滴度并没有非常显著的差别.这一结果出现的原因可能来自于不同表达载体对温度及宿主细胞的不同反应,且Kotani等[6] 实验结果来源于培养罐,其与培养皿中的差异有待探讨.对于去除包装细胞上清中的细胞及细胞碎片等成分的最佳方法目前并没有文献报道.离心与过滤法之间涉及安全指标问题.滤膜的种类较多,部分滤膜可因其表面电荷及SDS作用使病毒cfu滴度降低,我们选择Corning公司的Acrylic.45Micron滤器,于过滤前先以冷的PBS冲洗滤膜获得了较好的效果,与离心过滤之间未发现差别.综上所述,我们通过从包装细胞抗性集落的挑选到上清纯化之间的每一个步骤进行了比较性研究,从技术角度探讨了产生逆转录病毒包装细胞上清最佳化制备方法和条件,为以逆转录病毒载体进行的实验研究及临床应用奠定了基础.  
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