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日志

 
 

水溶性阳离子荧光共轭聚合物作为荧光探针测定三磷酸腺苷  

2015-01-16 21:38:57|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  利用荧光光谱研究了三磷酸腺苷(ATP)与水溶性阳离子荧光共轭聚合物的相互作用,发现加入ATP后,聚合物的荧光强度被显著猝灭,且猝灭程度与ATP的加入量成正比,据此建立了测定ATP的方法。荧光光谱的激发波长选择395 nm,发射波长为521 nm,激发狭缝宽度为10.0 nm,发射狭缝宽度为10.0 nm。在0.05 mol/L TrisHCl缓冲溶液(pH=7.4)中,测定ATP的线性范围为8.0×10-8~1.0×10-5 mol/L; 检出限为2.0×10-8 mol/L; 回收率在93.6%~105.6%之间; 相对标准偏差在2.2%~6.9%之间。本方法用于三磷酸腺苷二钠药片和鲫鱼肉中ATP的测定,获得满意结果。

【关键词】  荧光共轭聚合物;荧光光谱;三磷酸腺苷二钠

 1 引 言

  三磷酸腺苷(ATP)是生物体中重要的能量物质[1],建立快速、简便监测ATP的方法对于深入研究其功能具有重要意义。目前,测定ATP含量的方法主要有电化学分析法[2]、生物发光法[3]、高效液相色谱法[4]、毛细管区带电泳法[5]及荧光光谱法[6]等。但电化学分析法、生物发光法、毛细管区带电泳法和高效液相色谱法存在仪器昂贵、操作繁琐等缺点,而ATP检测试剂盒价格较高, 试剂保存条件苛刻,不利于反复使用。虽然检测ATP的方法在不断改进,但灵敏度和选择性仍然难以满足实际需要。荧光光谱法具有操作简便、灵敏度高、选择性好等特点,作为荧光探针的有小分子[7]、聚合物[8]及量子点等[9]。水溶性荧光共轭聚合物作为一类新型荧光探针具有摩尔吸光系数大、荧光量子产率高等优点,还具有“分子导线”的功能,能够实现荧光信号的放大,常用于生物大分子和生物小分子的检测等[10~13]。

  本实验采用的水溶性阳离子荧光共轭聚合物(WCFP)属于一种聚噻吩衍生物。噻吩是五元环结构,符合休克尔规则,具有适中的能隙、较宽的光谱响应、良好的环境稳定性和热稳定性,是一类性能优异的π电子系共轭光、电材料[14,15]。利用WCFP与ATP相互作用的荧光光谱特性,建立了以WCFP为荧光探针测定ATP的新方法,并将本方法应用于三磷酸腺苷二钠药片和鲫鱼肉中ATP的测定,结果令人满意。本方法不仅简便、准确,试剂稳定、重现性好,而且具有反应时间短,试剂用量少,污染小等优点。

  2 实验部分

  2.1 仪器与试剂

  LS55型荧光光谱仪(美国Perkin Elmer公司),Nicolet Evolution 300型紫外可见分光光度计(美国热电公司)。本实验所采用的WCFP属于一种聚噻吩衍生物,结构见图1插图。单体的相对分子量为285.57,按文献[16]方法合成。ATP(相对分子量为605.2,上海伯奥生物科技有限公司);WCFP和ATP均配制成2.00 × 10-5mol/L的储备液,其中WCFP浓度以单位计;其它试剂均为分析纯,所用纯水来自Aquapro纯水系统(中国重庆颐洋有限公司,18 MΩ·cm)。0.5 mol/L TrisHCl缓冲液。

  2.2 实验方法

  荧光光谱的激发波长为395 nm,发射波长为521 nm,激发和发射光谱宽度带为10.0 nm。实验考察了缓冲溶液、pH值、离子强度、干扰离子等对ATP猝灭聚合物荧光光谱的影响。

  3 结果与讨论

  3.1 ATP 对WCFP荧光光谱的影响

  由加入ATP前后WCFP的荧光光谱(图1)可见,WCFP的最大发射波长均为521 nm(曲线a)。随着ATP浓度的增加,WCFP的荧光强度逐步下降(曲线b~i),但其最大发射波长并未发生改变。

  3.2 缓冲溶液和酸度的影响

  考察不同缓冲溶液对体系的影响,发现磷酸盐缓冲溶液对聚合物荧光猝灭较强,影响检测灵敏度;TrisHCl缓冲溶液较好。当TrisHCl缓冲溶液浓度从0.01 mol/L增大到0.10 mol/L时,荧光猝灭程度逐渐增强;当TrisHCl浓度达到0.04 mol/L时,相对荧光猝灭程度变化趋于平缓。因此,选择0.05 mol/L TrisHCl缓冲溶液。

  图2为不同pH条件下ATP对WCFP荧光的影响。在 pH 6~9之间,加入ATP前后荧光强度较为稳定,并且在此pH区间体系被猝灭程度最大。由于此实验是研究生理条件下水溶性阳离子荧光聚合物与ATP的相互作用,因此选用反应的最适TrisHCl缓冲溶液(pH 7.4)。

  3.3 工作曲线及检出限

  WCFP浓度对ATP测定有一定的影响,当WCFP浓度过大时,会导致检测灵敏度变低;而WCFP浓度过小又会影响测定线性范围。本实验选择最佳浓度为4.0×10-6 mol/L(按单体计)。将不同量ATP加入到阳离子荧光聚合物溶液中,在最佳实验条件分别测定其荧光强度猝灭值ΔF,得到工作曲线,其相应的线性回归方程和相关系数分别为Y=0.81x+10.2,r=0.98,n=5。平行测定12次空白溶液的荧光强度,计算其标准偏差,以3倍的标准偏差除以标准工作曲线的斜率的方法得检出限为2.0×10-8 mol/L。

  3.4 干扰物质的测定

  混合体系中阳离子荧光聚合物浓度为4.0 μmol/L,ATP浓度为0.4 μmol/L,考察了共存物质的干扰情况。结果表明,以相对荧光强度变化为±5%计,共存组分允许存在的浓度见表1。1000倍的谷氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸、组氨酸、丙氨酸、乙醇、蔗糖、葡萄糖、NH4Cl、NaNO3、KF、NaBr;600倍的异亮氨酸、甲硫氨酸、NaH2PO4、乙酸钠; 500倍的Na2CO3; 300倍的Na2HPO4、K2SO4; 100倍的苯丙氨酸、Na3PO4、NaI; 25倍的有柠檬酸钠、ZnNO3、MgCl2; 12倍的La(NO3)3、Al(NO3)3, 测定干扰在5%以内。小牛胸腺DNA、牛血清白蛋白(BSA)和腺嘌啉的干扰严重。

3.5 样品中ATP含量的测定

  取2片三磷酸腺苷二钠药片(每片含量20 mg),加入三氯乙酸0.30 g,过滤,用超纯水定容至100 mL,再逐级稀释至测定ATP的线性范围之内。新鲜鲫鱼购于当地市场,去除鱼鳞、鱼皮和鱼刺,用表1 干扰物质的测定  error (%)LAlanine5.0×10-4-3.5NH4Cl5.0×10-4+3.9LGlutamine5.0×10-4-1.7NaNO35.0×10-4+1.1LMethionine2.5×10-4-3.1CH3COONa2.5×10-4+2.5LLeucine5.0×10-4-2.4KF5.0×10-4-1.5LTryptophane4.0×10-4-3.8NaBr4.0×10-4-3.0LThreonine5.0×10-4-1.5NaI4.0×10-5-4.6LIsoleucine2.5×10-4-4.3Na2CO32.0×10-4-4.2LHistidine5.0×10-4+2.5K2SO41.5×10-4-4.5Phenylalanine5.0×10-5-4.0MgCl21.5×10-5+2.0CH3CH2OH5.0×10-4+1.5Zn(NO3)21.0×10-5+4.5C12H22O112.0×10-4+3.9La(NO3)35.0×10-6+3.5C6H12O65.0×10-4+1.9Al(NO3)35.0×10-6+3.8NaH2PO42.5×10-4-2.6Trisodium citrate1.0 ×10-5-4.5Na2HPO41.25×10-4-2.5牛血清白蛋白 BSA1.0×10-7-1.5Na3PO45.0×10-5-2.0腺嘌呤 Adenine2.0×10-8-2.5小牛胸腺 DNA4.8×10-8-2.2 高速组织捣碎机捣碎。根据文献[17]处理方法提取ATP,准确称取1.0 g已捣碎鲜鱼肉样品,加10倍体积(15 mL)的4 mol/L HClO4,漩涡混匀器混匀1 min,冰浴1 min,重复7次后,以6000 r/min离心30 min,取上清液2.0 mL,加入1.8 mL 4 mol/L KOH中和,再以3500 r/min离心5 min,取所得混合溶液稀释到测定ATP的线性范围之内。以上测定均以0.05 mol/L TrisHCl(pH=7.4)控制溶液的pH值,ATP固体标样均在样品制备处理前加入。测定结果见表2, 取得满意的回收率。表2 药片及鱼肉中ATP含量的测定

  3.6 作用机理探讨

  由于WCFP带有大量的正电荷,常用于DNA快速高灵敏检测,其原理主要基于其与DNA之间的静电相互作用[18]。为了探讨WCFP与ATP的作用机理,考察了离子强度对反应体系的影响(见图3)。如图3所示,固定ATP与WCFP浓度不变,在反应体系中不断增加NaCl的浓度,可以看出,荧光强度比值

  图3 离子强度对体系荧光强度的影响

  Fig.3 Effect of NaCl on the fluorescence intensity of WCFP and WCFPATP at 0.05 mol/L pH=7.4 TrisHCl buffer. The concentration of ATP and WCFP were 4.0×10-7 and 4.0×10-6 mol/L, respectively.(F0/F)随着溶液中离子强度的增加而减小。这说明水溶性阳离子荧光聚合物与ATP的相互作用受离子强度的影响较大,静电引力是其相互作用的主要作用力,这与文献[19]报道的WCFP与DNA的作用主要表现为静电作用是相吻合的。

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