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lican8341的博客

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日志

 
 

连接蛋白43磷酸化状态与缝隙连接通道功能的关系  

2015-01-23 22:23:39|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  缝隙连接(GJ是介导相邻细胞间直接通讯的特殊膜结构。连接蛋白43(Cx43的磷酸化与去磷酸化对GJ通道的功能有非常重要的影响。激活不同的蛋白激酶可引起Cx43的羧基端21个丝氨酸中的12个残基、6个酪氨基的2个残基(247、265磷酸化;通过点突变方法研究发现,这些特殊部位的磷酸化导致GJ通道功能改变。现就Cx43磷酸化状态与GJ通道功能的关系作一综述。

【关键词】  缝隙连接;连接蛋白43;磷酸化;去磷酸化

  研究表明,连接蛋白43(Cx43和细胞间隙连接通讯(GJIC在多种心血管疾病的发生、发展起重要作用。高血糖可以促进Cx43磷酸化,引起缝隙连接(GJ功能的改变。因此,研究Cx43的磷酸化状态改变与心脏GJ功能的关系,对阐明磷酸化对GJ的作用机制,阐明DM患者心律失常的发生机制有重要意义。

    1  GJ的结构

    GJ又称间隙连接、通讯连接,是由连接相邻2个细胞之间的连接通道排列而成的一种特殊膜结构。每个GJ通道由相邻2个细胞各提供1个相同或不同的连接子(亦称为半通道以非共价键对接而成的亲水通道,直径约1.5nm,允许分子质量低于1ku的离子或小分子物质通过,这是GJ执行各种生理功能的结构基础。连接子是由6个相同或不同的亚单位即Cx环绕排列成的中空小管,其外形如棒状,直径6~7nm。

    2  GJ的功能

    相邻细胞间通过GJ所介导的GJIC进行着信息、能量和物质的交换,参与细胞间物质交换的代谢偶联和电信号传递的电偶联,对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。其生理功能主要有①心脏和神经元组织中动作电位的快速传导,其中Cx43单通道电导为60~100ps[1];②细胞间代谢产物或营养物质和水分子的被动扩散,如核苷酸、ATP、葡萄糖等[2];③细胞间各种离子或第二信使如Ca2+、三磷酸肌醇及环化核苷酸的交流[3]。

    3  GJ功能的调节

    GJ通道的功能包括介导细胞间电耦联和化学耦联。评价GJ功能的方法主要有膜片钳技术和低分子染料通透试验。Cx43形成的GJ通道允许分子质量小于1000u和/或直径小于1.5nm的离子或小分子通过。由于GJ通道具有口径大、低选择性、开放稳定性及协作的双细胞结构等特点,因此GJ通道一般不被认为是通常意义上的离子通道,而被认为是具有自己独特结构、功能和特性的一种特殊通道。GJ通道的功能受多种因素的影响,这些因素主要有胞内pH值、Ca2+浓度、Cx的磷酸化状态、跨通道电压以及一些神经体液因子。胞内pH值降低可致GJ通道功能减弱甚至关闭,细胞间失去耦联。胞内Ca2+浓度下降时,GJ通道的电导呈剂量依赖性下降,而当胞内Ca2+浓度与pH值同时下降时,则电导下降更为明显[4~6]。

    4  Cx43

    4.1  Cx43的结构

    编码人类Cx43的基因位于6q22.3,全长约3.0kb。Cx基因家族是保守的,不同的Cx具有共同的结构特征。Cx43属于Cxα亚组,分子质量43ku,其蛋白质肽链由382个氨基酸构成,其中氨基酸1~242构成管道部分,243~382为细胞质尾部[7]。从氨基末端(N端至羧基末端(C端共出入细胞膜4次,形成2个胞外环和1个胞内环,4个α螺旋结构的跨膜片段,从N端至C端分别是M1~M4,N端和C端均位于细胞质内。Cx最为保守的区域是2个胞外环,其次是4个跨膜片段,N端保守性次于跨膜片段,亦为保守区域。胞内膨大的C端氨基酸数目和序列区别较大,是不同Cx的主要区别。Cx43的细胞质尾部在不同种属和不同组织间长度稍有变化[8]。另外,Cx的大多数功能调节位点也在C端[9]。

    4.2  Cx43的生命周期

    Cx43在SDS_PAGE上至少表现为P0~2等3条分子质量从40~46ku的区带。有时在P0和P1_Cx之间有1个次要的磷酸化条带P′;在有丝分裂细胞等还可以见到超磷酸化的Cx43条带P3。P0代表刚合成非磷酸化的Cx43,分子质量约40~42ku;P1代表部分磷酸化的Cx43,分子质量约43~44ku;P2代表高度磷酸化的Cx43,分子质量约46ku[10_11]。利用Cx43在电泳凝胶上移动性的改变,是判断其磷酸化较为简单和常用的方法。

    通常情况下,Cx43首先在内质网合成,然后转运至高尔基复合体,最后在细胞膜上聚集形成GJ[12],但在转运至细胞膜之前,是否有先形成寡聚体则仍不清楚。在应激条件下,GJ单位通过胞吞,被从斑块的中央加速移除,形成环状GJ,与胞吞小体结合,进而被溶酶体降解。Cx处于动态变化过程,Cx43的半衰期约1~3h[13]。较短的半衰期对快速调节通道数量具有重要意义。

    5  GJ通道功能调节与CX43磷酸化状态的关系蛋白质磷酸化作用是真核细胞信号转导中的核心,通常磷酸化作为一个分子开关在不同通路如代谢、信号转导和细胞分裂等控制着蛋白质的活性,蛋白质的磷酸化参与酶的作用机制,以及介导蛋白质的活性。

    CX43的磷酸化与去磷酸化对GJ通道的功能有非常重要的影响[14],CX43的C端241~382为主要磷酸化区,也是多种激素的识别位点,丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸残基的磷酸化程度决定着GJ通道的通透性及功能,在心肌细胞,CX43的磷酸化使GJ通道开放,去磷酸化使该通道关闭,而且是该通道解聚的关键点,CX43一旦去磷酸化,该通道即开始解聚为Cx亚单位,而Cx亚单位可以进一步解聚或转入细胞内储存,对大多数细胞如平滑肌细胞、肝上皮细胞Cx磷酸化则导致GJIC的中断Cx翻译后经磷酸化而发生结构及功能的改变,磷酸化在Cx的生命周期(如运输、合成、分解、降解以及GJ通道的门控方面起着重要的调控作用。

    5.1  蛋白酪氨酸激酶(PTK

    5.1.1  非受体PTK  c_Src蛋白激酶是正常细胞的酪氨酸特异性蛋白激酶,而其基因轻微改变后表达的v_Src蛋白激酶则是一种致瘤性蛋白激酶。Src通过多种机制影响Cx43通道功能:①作用于蛋白激酶C(PKC、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK等丝氨酸激酶,进而磷酸化Cx43,抑制通道功能;②影响能作用于通道功能的蛋白质的表达;③直接磷酸化Cx43[15]。v_Src直接磷酸化Cx43的Tyr247和Tyr265位点,引起通道关闭,可能与降低通道开放概率有关,而非通过降低单通道传导性[16]。Tyr265位点突变,v_Src则无法磷酸化Cx43,但单纯的Tyr265位点磷酸化并不足以使通道关闭,只有进一步磷酸化Tyr247才使得通道关闭,可能的作用方式:v_Src通过SH3结构域与Cx43富含脯氨酸的274~283区域结合;接着磷酸化Cx43,主要在Tyr265;v_Src的SH2与Cx43 Tyr265对接,增加亲和力并使Src磷酸化Tyr247导致通道关闭[17]。

    5.1.2  受体PTK  表皮生长因子(EGF可引起Cx43的磷酸化,主要作用在Ser残基。EGF激活相应受体的酪氨酸蛋白激酶活性,通过MAPKs引起Cx43S255、S279、S282磷酸化,降低通道开放概率,使通道关闭[18]。血小板衍化生长因子引起的Cx43通道功能中断则不只与Cx43的磷酸化或MAPKs的活化有关,还可能需要另外的信号途径,但具体磷酸化Ser的哪个位点仍不清楚。

 5.2  丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶

    5.2.1  MAPKs  包括ERK1/2、BMK_1(ERK5、p38、JNK等。MAPK可磷酸化Cx43的Ser279和Ser282等位点,引起的GJIC快速短暂性降低[19_20]。

    5.2.2  PKC  在体外,PKC可磷酸化Cx43的Ser372和Ser368位点。PKC的激动剂,如12_O_十四烷酰佛波醋酸酯_13、佛波醇乙酯可增强S262和S368的磷酸化程度,前者的磷酸化使得细胞增生增强,但具体机制未明,后者通过降低单一通道传导性来降低GJ功能[21,10]。高糖可以通过PKC高磷酸化Cx43的Ser368位点从而抑制平滑肌细胞的GJIC[22]。另有报道,高糖通过PKC高磷酸化Cx43,刺激Cx43的降解,从而抑制肾小管内皮细胞的GJIC[23]。EK_VITORIN等[24]研究发现,PKC高磷酸化Cx43的Ser368位点,降低通道的选择通透性,降低GJ功能。

    5.2.3  蛋白激酶A(PKA  Ser364位点的磷酸化对cAMP上调Cx43的组装很关键,该过程由PKA介导,但PKA是否直接磷酸化Cx43的这个位点,还是通过活化其它酶再引起该位点的磷酸化仍不十分清楚[25]。磷酸化的Ser364可能对cAMP引起的GJ装配增加起关键作用,而对基础状态下的GJ装配的作用较为次要[26]。YOGO等[27]发现卵泡刺激素可引起大鼠颗粒细胞Cx43的Ser365、Ser368、Ser369、Ser373等位点的超磷酸化,并证明这些位点的磷酸化由PKA介导,这4个位点的超磷酸化增强了通道的形成及功能。

    5.2.4  蛋白激酶G(PKG  在大鼠心肌细胞中,环磷酸鸟苷可激活PKG,能通过磷酸化Cx43的Ser257,降低单通道传导性,使细胞间传导性和对染料的通透性降低[28]。

    5.2.5  酪蛋白激酶1(CK1  体外CK1,特别是其delta亚型,可直接磷酸化Cx43的Ser325、Ser328或Ser330等位点,调节细胞膜上的Cx43装配形成GJ通道,抑制CK1减少Cx43的磷酸化,伴随Cx43朝向细胞膜的减少[29]。LAMPE等[30]研究提示,Ser325/328/330的磷酸化可影响通道的选择通透性及装配,将Ser325/328/330位点突变为丙氨酸后,通道功能明显下降,表现为染料罗氏黄转移能力降低,该过程由CK1介导,心肌缺血通过降低Cx43的磷酸化程度,降低通道功能。

    5.2.6  细胞分裂周期蛋白激酶2  是一种蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶,对有丝分裂的正确起始有重要作用。其在Cx43的作用靶点可能是Ser255,可磷酸化Cx43的Ser255,或通过激活其他激酶使Cx43磷酸化,使GJ通道转移至细胞内,引起GJIC短暂的降低[31]。

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