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lican8341的博客

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日志

 
 

抗菌肽cecropin-Xm在大肠埃希菌中的串联表达与抑瘤作用  

2015-01-04 21:56:01|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  在TNFα基因3′端连接抗菌肽cecropin-Xm基因多拷贝串联体,与温度诱导的表达载体pRCs组成表达载体pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3),并在大肠埃希菌BL21(DE3)中诱导表达融合蛋白TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)。SDS-PAGE结果显示,在同样表达条件下应用BL21(DE3)/pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)2表达系统可获得比BL21(DE3)/pRCs-TNFα-cecropin-Xm系统多出一倍的目的物cecropin-Xm。融合蛋白经CNBr切割后用CM52纤维素柱分离纯化得到纯度大于95%的具有抑菌活性的抗菌肽cecropin-Xm,体外MTT抑瘤实验表明cecropin-Xm具有广谱杀灭肿瘤细胞的作用并且对正常细胞影响极小。

【关键词】  抗菌肽; Cecropin-Xm; 基因串联; 抑瘤作用

     抗菌肽cecropins是瑞典科学家Boman于1980年首先从惜古比天蚕中发现的[1],后来在其它蚕类、昆虫和哺乳动物[2,3]中发现了各种类型的抗菌肽,其中包括多种cecropin类的抗菌肽。抗菌肽cecropins一般由33~39个氨基酸组成,具有高度的同源性,对革兰阳性菌和阴性菌都有杀伤力,对正常真核细胞没有影响[4]。有实验表明,抗菌肽的作用对象和作用机制各异,其中某些抗菌肽可以通过引起肿瘤细胞凋亡[5]和激活经典的补体途径等来杀伤肿瘤细胞[6]。

    为了更好的研究cecropin类的抗菌肽,本实验室参照抗菌肽CMIV[7]的氨基酸序列,用化学方法合成了编码抗菌肽CMIV突变体cecropin-X的cDNA[8],并在大肠埃希菌中进行表达研究[9]。为了获得易于后期纯化且稳定的表达系统,在pRC系统[10]中完成了抗菌肽cecropin-X基因与TNFα(天然型肿瘤坏死因子)的融合表达[11]。为了从源头上提高抗菌肽的产量,首先利用PCR方法在cecropin-X基因末端加入了甲硫氨酸的密码子, 得到了cecropin-Xm基因; 再将cecropin-Xm基因串联在TNFα基因的3′-端。在此基础上,完成了TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)的串联表达,纯化得到了与cecropin-X具有同样抑菌活力的高纯度的cecropin-Xm。在体外实验中,cecropin-Xm对多种人源肿瘤细胞表现出明显的抑制作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌种和质粒  克隆宿主菌E.coli TOP10,表达宿主菌E.coli BL21(DE3)由本实验室保存;测活菌E.coli K12D31由斯德哥尔摩大学Boman教授馈赠;质粒pRC(含PR启动子的原核高效表达载体,温度诱导表达)由中国科学院上海生物工程研究中心陈常庆教授馈赠[10]。

    1.1.2  酶、试剂和层析介质  各种限制性内切酶和T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、琼脂糖均购自TaKaRa公司;酵母抽提物和胰蛋白胨为英国Oxoid公司产品; CNBr为Sigma公司产品;氨苄西林购自上海新先锋制药厂; SE Perfect 100bp DNA ladder购自上海申能博彩公司;SDS-PAGE分子量标准蛋白购自中科院生化所;低分子量标准蛋白质为Promega公司产品;其它化学试剂均为国产分析纯;CM-52纤维素购自Amershma Phamacia公司。PCR引物合成和基因测序由上海申能博彩公司完成。

    1.1.3  细胞株  人肝癌细胞HepG2和QGY-7703、人胃癌细胞BGC-823、人大肠癌细胞LOVO、人宫颈癌细胞Hela、人白血病细胞U937和HL60由本实验室保存;人胚肝细胞HL-7702由东南大学遗传中心谢维教授馈赠。PRMI1640购自Gibco公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程公司;MTT购自Sigma公司。

    1.1.4  主要仪器和设备  SCS-24型摇床(上海市离心机械研究所);5415R型台式离心机(Eppendorf公司);PTC-100型PCR仪(Bio-RAD公司);1100 System高效液相色谱仪(Agilent公司);SAFIRE型多功能酶标仪(TECAN公司)。

    1.2  方法

    1.2.1  表达载体pRCs的获得 

    (1)取质粒pRC用EcoRI和PstI酶切后回收;(2)合成互补的寡核苷酸链  ①5′-AATTCGTCGACGGATCCCTGCA-3′和②5′-GGGATCCGTCGACG-3′,加入T4 DNA连接缓冲液,85℃加热5min后自然冷却至室温;(3)将(1)和(2)的产物连接后转化入E.coli TOP10感受态细胞中,涂布LB(含氨苄西林100μg/ml,如无特殊说明以下同)平板,30℃培养过夜;(4)对随机挑选的5个克隆进行测序鉴定。

    1.2.2  表达质粒pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)的获得

    (1)取本实验室构建的质粒pRC-TNFα-(cecropin-X)[11],用EcoRI、SalI酶切并回收TNFα片段;(2)质粒pRC-TNFα-(cecropin-X)为模板,寡核苷酸链③,5′-CGGTCGACATGAGATGGAAAATC-3′为5′端引物,分别以寡核苷酸链④,5′-CCGGATCCACTACATGTTGATGGTAGCAGC-3′和⑤,5′-CGGTCGACCATGTTGATGGTAGCAGC-3′为3′端引物,利用PCR扩增[11]获得末端加入甲硫氨酸密码子(ATG)和终止密码子(TAG)的cecropin-Xm基因片段Xm-a,以及末端仅含甲硫氨酸密码子(ATG)的cecropin-Xm基因片段Xm-b,回收相应片段;(3)分别用EcoRI和BamHI酶切质粒pRCs;SalI和BamHI酶切Xm-a;SalI酶切Xm-b,回收pRCs、Xm-a和Xm-b;(4)将上述(1)和(3)产物连接后转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,涂布LB平板,30℃培养过夜;(5)挑选单克隆后提取质粒,用EcoRI和PstI酶切后行1%琼脂糖电泳检查。将有特异性片段的克隆进行测序鉴定。

    1.2.3  重组融合蛋白的表达、cecropin-Xm的纯化和抑菌活性检测  (1)将含重组质粒的菌落接种至LB培养基中30℃培养过夜,按1%转接后30℃培养2h,使菌体密度(A600)达到0.6左右,迅速升温至42℃再培养4h;(2)4℃,5000r/min离心5min收集菌体,在PBS溶液中用超声波破碎菌体;4℃,13000r/min离心10min收集包涵体。用6mol/L尿素溶解包涵体,加CNBr在25℃中避光切割24h,将切割产物于0.05mol/L NH4Ac中透析48h。透析产物在4℃,13000r/min离心10min,取上清上CM-52纤维素柱,用0.05~0.75mol/L NH4Ac梯度洗脱;(3)收集洗脱峰,各取5μl点在含E.coli K12D31菌体平面上测活,37℃培养过夜,观察抑菌圈。

    1.2.4  Cecropin-Xm的纯度鉴定  (1)低分子量蛋白SDS-PAGE参考Schagger等的方法[12],上样胶和分离胶的浓度分别为4%和16.5%;(2)RP-HPLC条件如下:使用Agilent Zorbax 300Extend-C18柱(150mm×4.6mm,5μm),缓冲溶液A为含0.1% TFA水(V/V),缓冲溶液B为含0.1% TFA乙腈(V/V)。浓度线性梯度为0~10min内缓冲溶液B由0到26.5%;10~40min内缓冲溶液B由26.5%到33.0%;40~50min内缓冲溶液B由33.0%到100%;流速为0.7ml/min,检测波长220nm。

    1.2.5  Cecropin-Xm的抑瘤活性  取生长良好的HepG2、QGY-7703、BGC-823、LOVO、U937以及HL60、Hela、HL-7702细胞,用含10%小牛血清的PRMI1640培养液将细胞稀释为2×105个/ml细胞悬液,按每孔100μl加入96孔细胞培养板中,培养过夜,加入经无菌过滤的不同浓度cecropin-Xm各100μl。同时设阴性对照和阳性药物环磷酰胺对照组,37℃下,在含有5% CO2的培养箱中孵育24h,每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20μl,继续培养4h后去上清夜,加入DMSO 100μl/孔,在酶标仪上检测595nm/635nm的吸光度(A)值。实验重复3次。计算细胞的增殖抑制率,并计算半数抑制浓度(IC50)。

    细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A均数   对照组A均数)×100%

    1.2.6  PCR反应条件  PCR反应条件、产物鉴定、连接和阳性克隆的鉴定均参照文献[11]。

    2  结果

    2.1  抗菌肽cecropin-Xm基因与表达载体pRCs的获得及重组质粒pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)的构建

    2.1.1  表达载体pRCs的获得  原始的表达载体pRC(3450bp)中多克隆位点的排列顺序为EcoR-NcoI-XhoI-BamHI-SalI-PstI-HindIII,其中BamHI在EcoRI和SalI中间。为了便于后续基因片段的插入,我们合成了互补的寡核苷酸链①和②(见方法1.2.1),将它们的退火产物与pRC载体(经EcoRI和PstI酶切)连接,即合成了表达载体pRCs(3435bp),将pRC载体的多克隆位点的排列顺序改造为EcoRI-SalI-BamHI-PstI-HindIII。

    2.1.2  重组质粒pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)的构建

    (1)将质粒pRC-TNFα-(cecropin-X)[11]用EcoRI、SalI完全酶切,回收TNFα片段(490bp),即得到含起始密码子但不含终止密码子的两端分别带EcoRI、SalI酶切位点的TNFα片段。将此片段与上述得到的载体pRCs(经EcoRI、SalI酶切后回收)连接即得到质粒pRCs-TNFα(3945bp)。

    (2)以质粒pRC-TNFα-(cecropin-X)为模板,寡核苷酸链③/④和③/⑤(见方法1.2.2)为引物,分别获得末端加入甲硫氨酸密码子(ATG)和终止密码子(TAG)的cecropin-Xm基因片段Xm-a(两端分别带SalI和BamHI酶切位点)和末端仅含甲硫氨酸密码子(ATG)的cecropin-Xm基因片段Xm-b(两端都带SalI酶切位点)。

  (3)将质粒pRCs-TNFα用SalI和BamHI酶切后回收与经过相应酶切回收后的基因片段Xm-a(131bp)和Xm-b(134bp)连接后转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,涂布LB平板,30℃培养过夜。整个构建过程如Fig.1所示。以加入一个Xm-b基因片段为例,其中①~⑤分别对应方法1.2.1和1.2.2中的寡核苷酸链。调整Xm-a和Xm-b的加入量和加入时间,则可获得含n个(n≥1)cecropin-Xm基因的重组质粒pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)2(4210bp);(4)挑选质粒pRCs和pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)用EcoRI和PstI酶切后进行电泳检查(Fig.2),可以看出各质粒中切下的核酸片段大小与所含的cecropin-Xm的个数相符,分别大于600bp,700bp和800bp(Fig.2中用黑色箭头表示)。分别挑取一个pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)菌落,送上海博彩公司测序,序列正确。

    2.2  重组蛋白的表达

    含不同cecropin-X基因数的重组质粒pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)的大肠埃希菌经温度诱导表达。SDS-PAGE检测结果(Fig.3)表明,当n    pRC-T-X: pRC-TNFα-cecropin-X;  pRCs-T: pRCs-TNFα;

    pRCs-T-Xm2: pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)2

    Fig.1    Construction of pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)2

    M: SE Perfect 100bp DNA ladder;  0: pRCs;

    1~3: pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n(n=1,2,3)

    Fig.2    Electrophoresis of pRCs and pRCs-TNFα-

    (cecropin Xm)n (n=1,2,3) cleaved with

    restriction enzymes EcoRI 和PstI

    值为1,2,3时,诱导表达的融合蛋白的分子量相应为21000、26000和31000ku左右(Fig.3中分别用黑色箭头表示),Fig.3结果显示含有2个cecropin-Xm基因的重组质粒融合蛋白表达量比只有单个基因的略高,但含有3个cecropin-Xm基因的重组质粒融合蛋白表达量则明显减少。

    2.3  Cecropin-Xm的纯度鉴定和抑菌活性比较

    2.3.1  融合蛋白TNFα-(cecropin-Xm)经CNBr切割后,经CM-52纤维素柱分离纯化得到的cecropin-Xm通过SDS-PAGE检查及银染呈现一条带,分子量约为    1: Protein marker;  2: BL21(DE3);  3: BL21(DE3)/pRCs;

    4~6: BL21(DE3)/pRCs-TNFα-(cecropin-Xm)n (n=1,2,3)

    Fig.3    Expression of TNFα-(cecropin-Xm)n (n=1,2,3)

    in E.coli BL21(DE3)

    3800ku,用RP-HPLC检测纯度可达95%以上。

    2.3.2  各取5μl相同浓度的cecropin-X和cecropin-Xm纯化蛋白在大肠埃希菌K12D31的测平板,37℃培养过夜,测定其抑菌活性,结果见Tab.1,说明两者拥有同样的抗菌活性。

    2.4  Cecropin-Xm的抑瘤活性

    Cecropin-Xm纯化样品检测了对肿瘤细胞HepG2、QGY-7703、Hela、BGC-823、LOVO、U937、HL60和正常肝细胞HL-7702的IC50分别为100、6.30、10、160、15、10和>400μgmol/L,结果表明cecropin-Xm对我们目前所研究的肿瘤细胞都表现出不同程度的杀伤力,尤其对QGY-7703、BGC-823、U937和HL60细胞的活性作用更明显,而对正常肝细胞HL-7702不敏感。这就为将cecropin-Xm开发成为一种安全有效的抗肿瘤药物提供了初步的实验。

    3  讨论

    因为抗菌肽不仅杀菌还有抗病毒和抗肿瘤细胞而不破坏人体正常细胞等作用,因此正在农业、畜牧业、医药及食品工业中显示出越来越广阔的应用前景。通常研制和应用的抗菌肽均是从昆虫体液等天然物质中提取,来源途径广泛,但含量极低,提取步骤繁杂,很难获得大量高纯度的抗菌肽。随着分子生物学技术的广泛应用,人们开始采用酵母体系及昆虫或昆虫细胞体系进行基因表达。从工业化生产的角度考虑,在基因工程表达体系中,具有成本低、周期短、表达水平高、易于操作等优点的大肠埃希菌最理想。因此,相关研究单位对在大肠埃希菌中表达抗菌肽进行了各种尝试。本小组在完成了cecropin-X基因的克隆表达后,为了减少融合表达引起的目的蛋白的低含量,从源头上提高目的蛋白的收率,采用了构建多拷贝串联体的方法,以期获得更高表达量的目的蛋白。结果显示只有2个cecropin-Xm基因串联的重组质粒融合蛋白表达含量比只有单个cecropin-Xm基因的略高,含有3个cecropin-Xm基因串联的重组质粒融合蛋白含量则明显减少。我们还尝试了4个cecropin-Xm基因串联的重组质粒,但在SDS-PAGE检测时基本无特异性蛋白条带的出现。抗菌肽本身所含的丰富的正电荷可能是TNFα-多个(cecropin-Xm)基因串联(当n≥3时)融合蛋白低水平表达的主要原因[13]。Cecropin-Xm是带高度正电荷的肽,在宿主中表达时,n值越大它和核酸的结合机会越大,抑制了转录和翻译,最终导致低水平表达。因此,进一步的工作是寻找一种合适的方法消除这些正电荷的影响,如融合一段酸性肽使之以中性前体形式表达等。

    为了保证纯化过程中串联体分离效率,我们仍采用CNBr切割,在串联体间引入甲硫氨酸密码子(ATG)。有文献报道[14],抗菌肽末端的甲硫氨酸经CNBr作用后转变成高丝氨酸(homoserine),但不影响抗菌肽的生物活性。本实验证明cecropin-Xm与cecropin-X的抗大肠埃希菌E.coli K12D31活性基本相同。本研究结果还表明cecropin-Xm对多种人源肿瘤细胞有较明显的不同程度的杀伤作用,但对正常人胚肝细胞影响极小,进一步提示抗菌肽cecropin-Xm可能作为一种广谱的低毒副作用的抗肿瘤药物应用于临床。

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