注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

D二聚体及其测定方法探讨  

2015-01-06 20:58:35|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

【摘要】  D二聚体(DDimer)是纤维蛋白特异性降解产物,可有效地标志稳定的纤维蛋白的出现,其检测对血栓性疾病的诊断及治疗观察具有重要应用价值[1,2]。本文综述了D二聚体的形成及其主要的检测方法:凝集法、ELISA法、及酶联荧光分析法、免疫金标法。随着方法学的发展及市场推广,早已由科研项目转变为常规项目。

【关键词】  D二聚体;检测方法;纤溶


  纤溶酶(PL)可降解纤维蛋白原、纤维蛋白单体、交联性纤维蛋白。纤维蛋白原在凝血活酶作用下形成纤维蛋白单体,纤维蛋白单体由XⅢa作用下通过r' r' 键变成网状的多聚体,形成交联纤维蛋白。与此同时,在PL作用下产生各种大小不同片段的纤维蛋白降解产物。D二聚体则是含r' r' 键的片段,是交联纤维蛋白的特异性降解产物。所以血浆中检测D二聚体有助于血栓性疾病的早期诊断及对溶栓药物治疗的疗程监测和疗效考核[3]。本文就D二聚体的形成特性以及主要测定方法作一简单叙述。

  1  D二聚体的生成及特性

  1.1  D二聚体的形成  纤维蛋白原在凝血酶作用下转变为纤维蛋白,并最终形成稳定的纤维蛋白凝块。凝血酶生成后即与纤维蛋白原的底物部位作用,首先裂解纤维蛋白原分子中的2条Aα链的氨基端精氨酸16甘氨酸17键,释放出一对纤维蛋白肽A(FPA),由此产生α链新的氨基末端(甘氨酸—脯氨酸—精氨酸),生成纤维蛋白单体Ⅰ;然后凝血酶再裂解纤维蛋白单体Ⅰ分子中2条Bβ链的氨基端精氨酸14甘氨酸15键,释放出一对纤维蛋白肽B(FPB),由此产生β链新的氨基末端(甘氨酸—组氨酸—精氨酸),生成纤维蛋白单体Ⅱ;纤维蛋白单体Ⅰ与Ⅱ生成后即开始自发性聚合。FPA和FPB的释放分别出纤维蛋白单体中央E区的两种“聚合部位”。一个纤维蛋白单体中央E区的“聚合部位”可与另一个纤维蛋白单体外周D区的“互补部位”以非共价结合,这样两个纤维蛋白单体即会形成一部分重叠而又不稳定的非共价复合物,第三个纤维蛋白单体加入后能以同样方式与其中之一纤维蛋白单体相连,而由此形成的聚合体中,两个相邻单体的D区将发生端端聚合作用。如此纤维蛋白单体通过分子间ED区和DD区的相互作用形成可溶性纤维蛋白单体复合物。在因子XⅢa作用下(需Ca2+参与),相邻纤维蛋白单体的γ链可通过一条γ链的398或399位上的谷胺酰胺与另一纤维蛋白单体上γ链的406位赖氨酸之间形成ε(谷氨酰)赖氨酸键而快速共价交联,形成[ε(γglu)lys]n。纤维蛋白交联后将形成稳定的纤维蛋白凝块。形成的r' r' 连结键是原来纤维蛋白单体所不具备的[4~6]。PL对纤维蛋白(原)形成过程中的各个阶段均有降解作用,对纤维蛋白原,PL通过对精氨酸—赖氨酸的降解作用,先从纤维蛋白原Bβ链上裂解下来一个小肽段Bβ142,在Aα上裂解下来一种极附属物。极附属物由碎片A、B、C和H组成,留下的片段称为X片段。后者在纤溶酶作用下,裂解为D片段和Y片段,Y片段再进一步裂解为终产物D片段和E片段。纤溶酶对可溶性纤维蛋白单体复合物的降解作用,除形成X’、Y’、D、E’、片段和Aα极附属物外,还从Bβ链上裂解下Bβ1542小肽,统称为纤维蛋白降解产物(FgDPs)。而交联纤维蛋白在纤溶酶作用下,除形成X’、Y’、D、E’片段外,还形成DD、γγ二聚体、Aα极附属物及复合物1(DD/E)、复合物2(DY/DY)、复合物3(YY/DXD)和YXD/DXY等,统称为纤维蛋白降解产物(FbDPs)。D二聚体则是含r' r' 键的片段,是交联纤维蛋白的特异性降解产物[4~6]。

  1.2  D二聚体的特性  D二聚体的分子量为190 000,等电点(PI)为4.9~5.3,经β巯基乙醇还原后出现相当于81 000个r' r' 交联键。D二聚体在280 nm下克分子消光系数为17.8。D二聚体在体内的半衰期>3 h,主要通过肾脏排泄。正常人血浆中的D二聚体<400 μg/L,随检测方法不同略有差异。将一定浓度的D二聚体与人幼稚单核细胞白血病细胞系(NOMO1),发现D三聚体可刺激NOMO1分泌尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)和纤溶酶原激活剂抑制物2(PAI2),引起NOMO1表面组织因子(TF)表达活性增强。此外D二聚体还可促使NOMO1生成超氧阴离子,促进白细胞介素1α (IL1α )和白细胞介素1β(IL1β)的释放。DD的生成反映机体凝血和纤溶系统的激活,在各种血栓形成性疾病以及生理性高凝状态时均有升高。特别是对静脉血栓形成(venous thromboembolism,VTE)高度敏感,在VTE的排除诊断中具有重要价值。另外,DD在心血管疾病、DIC、恶性肿瘤等疾病时,也有明显变化,可反映疾病的严重程度、发展变化、以及疗效和顶后的有用指标[4,5]。

  2  D二聚体检测方法

  D二聚体的检测方法很多,本文按照被检测物质的性质不同H与抗原抗体复合物相结合的物质性质不同I介绍几种主要的测定方法,其中包括:与红细胞结合的方法、与乳胶颗粒结合的方法、与酶结合的方法、在与荧光染料结合的方法及与胶体金结合的方法[4]。

  2.1  自身红细胞凝集法  采用分别针对DD和红细胞上表位的双抗体, 当血中DD水平升高时,抗原抗体结合的增多而导致红细胞凝集,2 min内可以判断结果,为半定量的自身红细胞凝集试验。其优点是可在全血中检测,省去了离心制备血浆的麻烦。对VTE的敏感性和NPV分别为100%和97%~100%。如果仅对近端DVT而言,SimpliRed的敏感性和NPV也可达100%,特异性和PPV分别为58%和70%,它是一种有价值的筛选高危性近端DVT的方法[7]。

  2.2  乳胶凝集法  1983年Rylat t等将分离纯化的D聚体作抗原,按常规方法筛选,最后获得一株DD3B6/22的抗D聚体的单克隆抗体。1986年Elms将此单克隆抗体共价吸附在乳胶颗粒上,用于定性或根据其稀释度半定量测定标本中的D二聚体的含量。标本可采用肝素EDTA或构椽酸钠抗凝血浆,室温下可稳定3 d,4 ℃可保存2周。Hillyard用该法测定了515例未经选择的健康志愿者枸椽酸钠抗凝血浆。97. 7%均为阴性与ELISA比较显著相关,认为该法快速、特异、操作简单。不需特殊设备,特别适用于急诊测定[4,7]。

 2.3  酶联免疫吸附法(ELISA)  1983年Rylatt和Elms建立了双抗夹心的ELISA法检测血浆中的D二聚体。其包被抗体和酶标抗体均采用分离纯化后筛选出来的McAb(DD3B6/22)该McAb能特异性地针对D二聚体中的r' r' 连结键。该法灵敏度10 μg/L,正常范围<300 μg/L[4]。

  2.4  基于酶免疫法的荧光抗体检测法  VIDAS DD在VIDAS免疫分析仪上进行,它在酶免疫法基础上与荧光检测相结合。利用现成的单剂量试剂和分析仪中储存的校准系统,对单份样本进行检测。现成试剂由包被了鼠抗DD单抗的固相移液装置和一试剂条组成,后者包含了其他所需试剂:结合剂(碱性磷酸酶标记的鼠抗DD单抗)、洗涤剂、样品稀释剂和底物。将200 μl血浆吸入试剂条后,所有步骤由分析仪完成。除需将血样常规离心15 min外,结果可在35 min内得到。结果以纤维蛋白原等价单位表示,其检测上限为1 000 μg/L,下限为50 μg/L,低于正常参考值下限(68 μg/L~494 μg/L)。对DVT的敏感性和NPV分别为96%~99%和95%~99%。VIDAS DD是目前研究最多的一种检测方法,敏感性很高,与经典ELISA法有很好的一致性,最有希望取代经典ELISA法而成为DVT诊断的首选筛选试验[7]。

  2.5  免疫金标法  Gogstad用胶体金标记D二聚体的单克隆抗体,建立了免疫过滤金标染色测定法。本法将单抗吸附在多孔薄膜并粘放在有多层吸收垫的塑料盘上,被检标本加入后即与该抗体相结合,然后加入胶体金标记的抗体,在薄膜上产生红色斑点。通过肉眼观察或用折射仪读数,与提供的标准色价或者测定标准品的折射读数,可计算出标本中D二聚体的含量。该法即具有胶乳凝集法的操作简单、快速,适用于急诊测定的优点,又具有ELISA能够准确定量的特点,线性范围达到10 mg/L,与ELISA比较具有显著的相关性,不受胆红素,Hb、纤维蛋白原、可溶性的纤维蛋白及FDP等干扰,但类风湿因子、肝素及脂血等有一定的干扰。批内CV 8%~12%,批间CV 13%~20%,参考范围0.2 mg/L~0.47 mg/L[4,7]。

  3  总结

  以上介绍了DD的生成以及几种主要的DD检测方法,除了经典的胶乳法和ELISA法外,现已发展了10多种快速的DD的检测方法。这些新方法分别鉴于不同的原理,但与经典方法相比,都具有快速、简单、灵敏等优点,更适合于急诊患者的使用。有些新方法已经经过了大量的临床研究评估,得到了公认,在临床已广泛使用。还有一些新方法正在进行临床评估,方法的可靠性尚需进一步的研究证实。迄今,DD的最大临床意义是在排除诊断可疑VTE中的作用。DD对VTE高度敏感,如果患者的DD低于临界值水平,常可排除VTE。DD对血栓形成性疾病如弥漫性血管内凝血 (DIC)、肺栓塞(PE) 、深部静脉栓塞(DVT) 、急性心肌梗死(AMI)、先兆子病等有早期快速诊断价值。对严重肝病,恶性肿瘤,镰刀红细胞疾病的观察也具重要价值。此外,D二聚体的检测还可用于溶栓药物治疗的疗程监测和疗效考核[8~12。相信随着科学的不断进步,更多更好的检测D二聚体的方法将会不断出现,从而为广大医务工作者提供更多便利。

  评论这张
 
阅读(4)| 评论(0)
推荐 转载

历史上的今天

在LOFTER的更多文章

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2017