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日志

 
 

细胞骨架在高迁移率族蛋白B1诱导人脐静脉内皮细胞表达分泌IL6中的作用  

2015-02-13 22:33:36|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】    目的: 观察体外重组高迁移率族蛋白B1(HMGB1)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)分泌释放白介素-6(IL6)的量效关系,探讨细胞骨架在HMGB1诱导HUVEC释放IL6中的作用。方法: 构建原核表达质粒并表达纯化HisEGFPHMGB1及HisEGFP融合蛋白,刺激体外培养的HUVEC;利用液相芯片分析系统观察HMGB1及相关细胞骨架抑制剂作用或低温培养作用下细胞分泌IL6因子的情况。结果: 酶切和DNA测序证明所构建原核表达载体正确,表达纯化的重组蛋白经SDSPAGE电泳鉴定大小正确,刺激体外培养HUVEC后IL6高表达且具有明显量效关系;Nocodazole、Cytochalasin D等细胞骨架抑制剂作用及低温培养后可明显抑制IL6表达。结论: 体外重组的人HMGB1蛋白可以有效诱导HUVEC分泌和释放IL6,而细胞骨架结构在此过程中起重要作用,并具有明显的能量依赖性。

【关键词】  高迁移率族蛋白质类 细胞骨架 内皮 血管 脐静脉 人 白细胞介素6

  [Abstract] Objective: To understand the role of cytoskeleton in the expression of interleukin6 (IL6) in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) under the stimulation of the fusion HMGB1 protein. Methods: The coding sequence of HMGB1 was amplified and subcloned into pET14bMCSEGFP plasmid for the construction of fusion protein expressing vector. The recombinant vector was transformed and the expression of fusion protein was induced and purified. The fusion proteins and different cytoskeleton inhibitors were added to the cell culture media of HUVECs and IL6 level in the supernatant of the cell culture media was measured with LiquiChip system. Results: The recombinant vector was identified by PCR, endonucleases digestion and DNA sequencing. After protein was expressed and purified, the molecular mass and purity were assessed by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDSPAGE). High level expression of IL6 was detected in cell culture media dosedependently after stimulation of HMGB1. IL6 level was significantly decreased if be pretreated with Cytochalasin D and nocodazole or under the low temperature incubation. Conclusions: The fusion protein HMGB1 can induce the expression of IL6 in HUVECs effectively and cytoskeleton may play an important role in this process.

  [Key words] high mobility group proteins;cytoskeleton;endothelium, vascular; umbilical veins; persons;interleukin6
   
  高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein B1, HMGB1)广泛存在于真核细胞核中,具有多种重要的生物学功能,其作为核蛋白参与多种基因的表达调控,同时又可以被分泌到细胞外参与炎症反应、肿瘤发生和转移、神经细胞生长等重要生理病理过程。在由脓毒症引发的严重的全身炎症反应过程中,HMGB1参与并起重要作用。在炎症反应中,致炎物刺激细胞后延迟释放的HMGB1通过内分泌和旁分泌的形式又作用于单核、内皮等多种细胞,引起更多的炎症因子的释放和黏附分子的表达,引起级联放大的效应,导致炎症反应的进一步扩大。HMGB1作用于细胞导致炎症反应放大的相关信号过程是近几年国内外研究热点,本实验构建表达体外重组的HMGB1蛋白,并引入增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)作为内对照,观查HMGB1对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell ,HUVEC)中IL6的诱导表达情况,并初步研究细胞骨架在其中发挥的作用。

  1  材料和方法

  1.1  试剂 

  引物由上海博亚生物公司合成,1 kb DNA分子标准、KOD plus DNA聚合酶、限制性内切酶Kpn I、T4 DNA 连接酶购自日本ToYoBo公司,LB细菌培养基、胰蛋白酶购自美国Gibco BRL公司,琼脂糖购自西班牙Biowest公司,质粒微量提取试剂盒和DNA 纯化回收试剂盒购自美国Ugene公司,胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、RPMI 1640培养基购自美国Gibco公司,Ni2+NTAagrose、异丙基硫代βD半乳糖苷(isopropyβDthiogalactopyranoside, IPTG)、细胞因子检测试剂盒等购自德国Qiagen公司,Bradford蛋白定量试剂盒购自德国Merck公司。

  1.2  质粒和菌株 

  pET14bMCSEGFP由本室改造并保存,pGEX4THMGB1由日本Kimitoshi Kohno博士惠赠,大肠杆菌株DH5、BL21(DE3)由本实验室保存。

  1.3  融合蛋白表达载体的构建 

  用含有Kpn I酶切位点的上游引物5'catggtaccggcaaaggagatcctaagaagc3',下游引物5'catggtaccttcatcatcatcatcttcttcttcat3',从质粒pGEX4THMGB1上扩增HMGB1编码序列,插入载体pET14bMCSEGFP中。以高保真DNA聚合酶KOD plus行PCR反应,产物琼脂糖凝胶电泳回收后与质粒pET14bMCSEGFP行酶切反应,产物凝胶电泳回收后行去磷酸化反应,用等体积苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提2次,氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提1次,乙醇沉淀回收。T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接,连接反应产物转化DH5α感受态菌并接种到Amp+的LB琼脂培养板继续培养。挑取单菌落接种于AmpI+的LB培养液中扩增,小量提取质粒,行PCR、酶切及测序鉴定。构建所得原核表达载体命名为pET14bMCSHMGB1EGFP。

  1.4  融合蛋白的表达和纯化 
 
  构建所得的载体pET14bMCSHMGB1EGFP及原载体pET14bMCS EGFP分别一步法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞;挑取单菌落,接种于5 ml Amp+的LB培养液中,过夜培养后按1∶100扩大,培养至A600=0.5~0.6时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导培养5~6 h。依照His·BindTM Kit操作说明,离心(5 000×g,4 ℃,5 min)收集菌液,每200 ml培养液所得细菌沉淀以5 ml结合缓冲液重悬,冰上超声裂解细菌细胞,离心除去沉淀(39 000×g,4 ℃,20 min),收集上清液;将上清液转入加有Ni2+NTAagrose的层析柱中,用10倍体积的冲洗缓冲液洗涤3次,用0.5 ml洗脱缓冲液洗脱重组蛋白。SDSPAGE电泳检测纯化的各融合蛋白。洗脱的融合蛋白用3 kD截留生物半透膜透析脱盐,0.22 μm微孔滤膜过滤除菌,并应用Bradford法进行蛋白定量。

  1.5  HUVEC的分离和培养 

  将取自胎儿的新鲜脐带以无LPS的DHanks液冲洗内皮2~5次,每次10~20 ml;将脐静脉内淤血冲洗干净后,以1 g/L胶原酶37 ℃消化脐静脉内皮12~15 min,然后用含血清RPMI 1640培养基反复冲洗内皮;收集消化液及冲洗液,1 200 r/min离心8 min;弃去上清液,用含20% FBS的RPMI 1640培养基重悬细胞,并于含20% FBS、100 μg/L内皮细胞生长因子的RPMI 1640培养液中,37℃、5% CO2条件下培养。次日换液,除去未贴壁细胞,以后根据细胞生长情况每2~3 d换液一次。倒置显微镜观察传代细胞形态,Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测鉴定为血管内皮细胞。

  1.6  细胞的处理及待测样品的制备 

  于实验前24 h将HUVEC以1.5×104细胞/孔铺于96孔板中。24 h后更换无血清、无内皮细胞生长因子的RPMI 1640培养基继续培养,12 h后撤去培养上清液,加入含有重组融合蛋白或不同抑制剂的无血清、无内皮细胞生长因子的RPMI 1640培养液,于37 ℃,5 % CO2培养箱中继续培养,一定时间后收集细胞培养上清液于-80 ℃保存待测。抑制剂处理组先以5 μmol/L Nocodazole或5 μmol/L Cytochalasin D分别预处理细胞1 h,再加入50 nmol/L的HisHMGB1EGFP蛋白。

  1.7  细胞因子含量的检测 

  利用液相芯片分析系统(LiquiChip)对待测细胞培养上清液中IL6含量进行检测。待测细胞培养上清液于-80 ℃保存,检测前14 000 r/min离心15 min,取50 μl上清液加入96孔过滤板中,加入25 μl偶联有抗人细胞因子抗体的球形基质(一抗),漩涡混匀,室温避光振摇2 h。然后用真空泵从反应板底部将各孔中液体除去,加入75 μl检测缓冲液,轻轻振摇后,再次抽去液体,每孔加入75 μl检测缓冲液和25 μl生物素化的二抗,室温避光振摇1.5 h;每孔加入25 μl链霉亲和素偶联的藻红蛋白(phycoerythrin)溶液,室温避光振摇0.5 h;每孔加入25 μl终止缓冲液,室温避光振摇5 min后,用真空泵从反应板底部将各孔中液体除去,每孔加入125 μl测定缓冲液,室温避光振摇1 min;最后在LiquiChip液相蛋白芯片检测系统上读取各孔荧光强度。利用公司提供的标准品样品建立荧光强度和浓度标准曲线,根据标准曲线和待测样品荧光读值得到样品的细胞因子浓度。

  1.8  统计学处理 

  运用SPSS 11.0软件进行统计学分析,所有数据用x±s表示。采用析因设计资料的方差分析不同浓度HMGB1对HUVEC表达释放IL6的影响,固定浓度的两组间比较采用随机设计的t检验,不同浓度间比较、不同抑制剂对HMGB1诱导HUVEC释放IL6的影响采用Oneway ANOVA方差分析,P<0.05表示差异有显著性。

 2  结果

  2.1  重组质粒pET14bMCSHMGB1EGFP的鉴定 

  对构建质粒pET14bMCSHMGB1EGFP行PCR、酶切鉴定(图1),PCR扩增产物电泳可见特异的约650 bp的DNA片段,与插入的DNA序列大小相符;BamH I单酶切鉴定产物电泳可见5 kb和1.2 kb两条带,表明单点插入方向正确。DNA测序结果显示,质粒构建正确。

  2.2  HisHMGB1EGFP融合蛋白的表达和纯化 

  经IPTG大量诱导、His亲和树脂层析纯化目的蛋白、透析脱盐和过滤除菌后,取少量蛋白样品行SDSPAGE电泳和Bradford法蛋白定量,结果显示得到较纯净的重组融合蛋白HisEGFP和HisHMGB1EGFP,蛋白分别约32 kD 和55 kD(图2),与理论值一致,所得浓度满足实验要求。

  2.3  重组HMGB1蛋白对HUVEC细胞表达释放IL6的影响 

  以重组蛋白HisEGFP为阴性对照,以不同浓度HisHMGB1EGFP刺激HUVEC,24 h后检测培养上清中IL6含量,结果表明(表1,图3),不同HMGB1浓度组IL6升高值有显著意义,表明HMGB1作用于HUVEC可以显著诱导细胞表达释放IL6。50 nmol/L的HMGB1已经可以显著诱导IL6的表达和释放,刺激浓度为100 nmol/L时,IL6的释放水平已基本进入平台期。表1  HMGB1蛋白对HUVEC表达释放IL6的影响(略)注:(1)P<0.001。

  2.4  不同抑制剂对HMGB1诱导HUVEC释放IL6的影响  
  
  以空白处理为阴性对照,单独HisHMGB1EGFP处理为阳性对照,分别用Nocodazole、Cytochalasin D预处理或4 ℃条件培养观察终浓度为50 nmol/L HisHMGB1EGFP蛋白刺激细胞结果。于蛋白加入后6 h收集培养液上清检测IL6的含量。结果表明(表2),同阳性对照相比,Nocodazole、Cytochalasin D预处理以及低温条件培养处理均使IL6下降,具有显著性差异。表明各抑制剂均可有效抑制HMGB1诱导HUVEC释放IL6的作用。表2  不同抑制剂对HMGB1诱导HUVEC释放IL6的影响(略)注:方差分析F=292.88,P<0.001;与阳性对照比较,(1)P<0.001。

  3  讨论
      
  HMGB1是高迁移率蛋白超家族成员,广泛存在于真核细胞核中,是重要的非组蛋白之一 [1]。HMGB1具有极其丰富的生物学功能,可通过使染色质或DNA构形发生变化,调节转录起始复合物的形成,从而在基因表达调控中起重要作用[1]。研究还发现HMGB1可以被分泌到胞质或胞外,广泛参与炎症反应、肿瘤发生和转移、神经细胞生长等重要生理病理过程[2]。脓毒症是由感染引起的严重的全身炎症反应综合征[3],是临床危重患者的重要死因之一。HMGB1参与了脓毒症的发病过程[4],在致炎刺激脂多糖和TNFα、IL1活化单核巨噬细胞后8~32 h的延迟后释放HMGB1到细胞外,释放入血的HMGB1通过内分泌和旁分泌形式作用于单核、内皮等多种细胞,引起一系列炎症因子的释放和黏附分子的表达,导致炎症反应的进一步扩大[5]。研究表明,HUVEC受HMGB1刺激后可上调表达细胞黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1、E-选择素和IL8等[6]。此外,HMGB1还进一步刺激巨噬细胞释放更多的HMGB1入血,引起炎症的级联放大效应。HMGB1参与炎症反应的分子基础,特别是其诱导炎症细胞释放炎症因子的相关信号过程是近几年国内外研究热点[7]。晚期糖基化终末产物受体,Toll样受体2和Toll样受体4陆续被鉴定为HMGB1在细胞表面的受体[8,9],细胞内一些相关信号分子也得到鉴定。然而当阻断细胞表面所有这些受体仍不能完全抑制HMGB1对细胞的作用,表明HMGB1诱导炎症反应的相关信号机制存在着极大的复杂性[10]。
      
  细胞骨架不仅在维持细胞形态,承受外力,保持细胞内部结构的有序性方面起重要作用,而且还参与许多重要的生命活动,包括染色体分离、细胞中各类小泡和细胞器的定向转运以及白细胞迁移、精子游动、神经细胞轴突伸展等[11,12]。此外,研究表明,在多种信号分子的信息传递过程中,细胞骨架也可能起重要的作用。 
    
  本研究发现体外重组的人HMGB1刺激HUVEC诱导IL6的表达释放增多,50 nmol/L的刺激浓度就具有显著意义,而100 nmol/L的刺激浓度时IL6的释放基本到达平台,表明所构建的蛋白具有较好的生物活性和刺激灵敏度。
      
  细胞松弛素D可切断肌动蛋白微丝纤维,并结合在微丝末端抑制肌动蛋白加合到微丝纤维上;而诺考达唑是有效的微管解聚剂,特异性的抑制微管功能。实验中发现这两种药物都能有效地抑制IL6的释放,表明细胞在受到HMGB1刺激释放IL6的过程和细胞骨架是密切相关的,而具体的影响机制还有待于进一步的研究。此外,细胞在低温培养条件下不能受HMGB1诱导释放细胞因子,这表明这一诱导表达过程具有能量依赖性,也进一步支持了细胞骨架参与了这一过程的结论。
      
  我们所构建的HMGB1融合蛋白引入了EGFP标签,同时表达纯化了HisEGFP融合蛋白作为对照,相比以往类似实验采用无关蛋白作为对照更加合理。同时,两种蛋白在表达纯化过程中的操作一致性,可进一步排除纯化过程对结果带来的干扰,包括高盐洗脱液以及裂解细菌的内毒素污染等。结果表明,与HisEGFP相比较,HisHMGB1EGFP引起的IL6水平的增高具有显著的统计学意义,这些蛋白和方法的构建也为进一步研究奠定了基础。

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