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lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

聚二甲基硅氧烷芯片自由酶反应器检测葡萄糖  

2015-12-03 21:11:49|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】    应用电泳中介微分析(EMMA)技术,构建聚二甲基硅氧烷(PDMS)芯片自由酶反应器, 在线检测葡萄糖(Glu),在十字形的芯片通道上,采用自制的碳纤维微电极检测葡萄糖氧化酶(GOD)催化氧化Glu生成的H2O2,并对检测电位、GOD浓度、GOD进样时间、分离电压等参数进行了优化,测定了该自由酶反应器的线性范围和检出限,考察了其重现性及稳定性。结果表明,此自由酶反应器制作方便,操作简单,重现性好,Glu浓度在0.1~20 mmol/L之间有较好的线性关系(r=0.997),检出限为19.8 μmol/L(S/N=3)。

【关键词】  自由酶反应器; 葡萄糖; 电泳中介微分析; 聚二甲基硅氧烷芯片

  The Key Lab of Analytical Chemistry for Life Science, Ministry of Education, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093)Abstract  Microfluidic enzymebased reactor could be used to detect the biomolecules with high sensitivity and selectivity. Based on the electrophoretic mediated microanalysis (EMMA) method, a new kind of free enzymebased poly(dimethylsiloxane) (PDMS) microchip was developed to detect glucose (Glu). Online catalysis reaction of Glu by glucose oxidase (GOD) was carried out on the chip. The product H2O2 was detected using single carbon fibre cylindrical electrode. Factors influencing the separation and detection, such as detection potential, GOD concentration, GOD injection time and separation voltage, were investigated and optimized. Results showed that the peak current had a good linear relationship with Glu concentration in the range of 0.1-20 mmol/L (R=0.997). The detection limit of Glu was 19.8 μmol/L (S/N=3). In addition, the PDMS enzymebased reactor had longterm stability and excellent reproducibility (RSD=2.02%, n=10). It was easy to fabricate and operate, which showed great potential application in bioanalysis.

  Keywords  Free enzymebased microchip; Glucose; Electrophoretic mediated microanalysis; Poly(dimethylsiloxane)

  1  引  言

    近年来,基于酶催化反应的微流控芯片备受关注。它们将酶的高效性、高选择性以及信号放大性与芯片的高通量、低消耗、分析速度快以及高度集成化等特点相结合,为化学分析、医药研究、蛋白质组学和生物工程等领域的研究提供了强有力的研究平台[1~5]。
    
  目前已发展了多种类型的微流控芯片酶反应器,根据芯片中酶的存在形式,可分为自由酶反应器和固定化酶反应器。固定化酶反应器能使酶的稳定性提高,减少酶的消耗,可重复使用,不会干扰产物的分离检测[6~8],目前,区域化固定酶的方法主要有光附着法[9]、光聚合法[10,11]、微珠固定法[12]、原位合成金纳米粒子法[13]等,这些方法中酶在芯片通道内的固定步骤比较复杂,耗时。相比而言,自由酶反应器具有更好的灵活性,制作方便,操作简单。Wang等[14]在芯片上集成了葡萄糖(Glu)和乙醇与其对应的葡萄糖氧化酶(GOD)和脱氢酶的柱前反应,并以此实现了上述两种物质的同时检测。采用类似的方法他们还在微流控系统上实现了Glu、尿酸和抗坏血酸的电化学同时检测[15]。Zugel等[16]使用微流控芯片对一种具有重要临床意义的酶——亮氨酸氨肽酶(LAP)的动力学性质进行了研究。
    
  本研究将微流控芯片技术和电泳中介微分析(EMMA)[17]技术相结合,构建了简便的Glu自由酶反应器,通过电化学检测GOD催化氧化Glu生成的H2O2,实现了Glu的在线检测。

  2  实验部分

  2.1  仪器与试剂

    CHI660C(上海辰华电化学仪器有限公司),自制高压电源,碳纤维(d=8 μm, Goodfollow Co. Oxford, UK)。
    
  Sylgard 184型PDMS预聚体及固化剂(Dow Corning,Midland, MI, USA),Glu(国药集团化学试剂有限公司),GOD(美国AMResco公司),Na2HPO4(南京化学试剂一厂)。20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(PBS, pH 7.0,以0.22 μm 的混合纤维树脂孔滤膜(上海新亚净化器件厂)过滤)。Glu溶液,GOD溶液均由20 mmol/L PBS缓冲溶液配制。所用试剂均为分析纯。PDMS芯片水平放置在自制的集成有精密三维调节架(上海联谊光纤激光仪器厂)的有机玻璃底座上,如图1。 

  WE: 碳纤维工作电极(Carbon fiber cylindrical electrode); CE:对电极(Pt counter electrode); RE:参比电极(Ag/AgCl reference electrode); GE:接地电极(Pt ground electrode); PS:恒电势器(Potentiostat); HV:高压(High voltage); PC:电脑(Personal computer); A: Glu溶液池(Glucose solution reservoir); B:工作电极在管内部分(The tip of WE in channel); C:通道口(Channel outlet); D:玻璃毛细管(The tip of glass capillary); E: GOD溶液池(Glucose oxidase solution reservoir); F:废液池(Waste reservoir); BC = 40 μm; BD= 2 mm; AE= EG=EF=0.5 cm; EC=3.5 cm; 通道深(Depth of all channels): 18 μm; 进样通道宽(Width of sampling channel): 30 μm,分离通道宽(Width of separation channel): 50 μm。

  2.2  PDMS芯片及电极制作

    十字通道的PDMS芯片直接由模具浇铸法制成。含反转通道的硅模板由南京大学电子系制作。模板进样通道平均宽度为30 μm,深18 μm。分离通道呈梯形,宽度平均为50 μm,深18 μm,长4 cm。PDMS预聚体和固化剂按质量比10∶1混合,除气后倒在模板上,在80 ℃固化2 h后取出,待冷却后从模板上剥下含分离通道的PDMS芯片,用刀切割成所需形状。在样品池、样品废液池和缓冲溶液池处打直径2 mm的孔。在一个玻璃模板上用同样方法制得不含分离通道的PDMS盖片。两种PDMS薄片分别用丙酮、甲醇、水超声洗涤各20 min,在红外灯下烘干,用氧等离子体处理后封合待用。

  单根碳纤维柱电极的制作方法:用多功能玻璃微电极拉制仪将内径500 μm的玻璃毛细管拉制成尖端直径约50 μm 的微管。在显微镜下,将单根碳纤维(直径8 μm)穿入毛细管尖端中,用快速胶封口。风干后,在毛细管的另一端装入碳粉,然后用铜丝将碳粉塞紧,在显微镜下将碳纤维电极的尖端切到1.5 mm长,形成碳纤维柱电极。碳纤维柱电极于缓冲液中在+1.5 和-1.0 V下分别活化200 s可以得到较好的安培响应。采用三电极系统检测,Ag/AgCl为参比电极,Pt电极为对电极。将活化好的碳纤维柱电极,在显微镜下从分离通道出口处放入通道内,工作电极的尖端距离出口约40 μm。电化学检测采用“Amperometric it curve” 模式。所有实验均在室温下进行。

  2.3  电泳方法

    在分离通道A池中加入适量Glu溶液,加样通道F池加入100 U/mL GOD溶液, F和C端加电压进样, A和C端加电压分离,采用碳纤维微电极检测Glu在线酶反应生成的H2O2。

  3  结果与讨论 

  3.1  Glu在线酶反应的EMMA平台峰

    在氧等离子体封合的“十”字型PDMS芯片上进行GOD催化氧化Glu的在线自由酶反应,得到的EMMA电泳图如图2所示。

    Glu和H2O2是中性分子,其迁移速度与电渗流相同,而GOD等电点为4.2,在PBS缓冲液(pH=7.0)中带负电,其迁移速度小于电渗流。进样后Glu不断流经GOD的区带,产生H2O2。由图2可见,进样后分离约45 s,电极上开始检测到随电渗流一起到达检测端的H2O2,约130 s后GOD全部流出通道,H2O2信号减小为零,得到平台峰。

3.2  检测电位的优化

    电化学检测中,检测电位是决定灵敏度的最关键因素。5 mmol/L Glu在100 U/mL GOD的催化作用下生成H2O2,碳纤维微电极对其进行电化学检测。从表1可见,随着检测电位的增加,H2O2的峰电流也逐渐增大。由于碳纤维微电极承受电压超过+1.5 V(vs.Ag/AgCl)会容易软化,为延长碳纤维电极的使用寿命,H2O2的检测电位选择+1.4 V(vs.Ag/AgCl)。表1  不同检测电位下的峰电流(略)

  3.3  GOD浓度的优化由酶反应动力学可知,H2O2浓度与GOD及Glu溶液的浓度有关。当Glu浓度一定时,产生的H2O2的浓度与GOD的浓度在一定范围内成正比。当Glu反应完全时,H2O2的浓度不再增加。由图3可见, 检测条件(Detection conditions): 5 mmol/L Glu, 其它条件与图2相同(Other conditions are same as in Fig.2)。固定Glu的浓度为5 mmol/L,随着GOD的浓度从20 U/mL逐渐增大,H2O2的峰电流也逐渐增大;当GOD的浓度为80 U/mL时,H2O2的峰电流不再增加,趋于平台。为保证有足够的GOD参与反应,GOD的最佳浓度选择100 U/mL。表2  不同分离电压下的峰电流和出峰时间(略)

  3.4  GOD加样时间的优化

    自由酶反应器中GOD的量不仅与其浓度有关,也与进样时间有关。在10~50 s改变进样时间,随着时间增加,峰电流逐渐增大,但峰形也变得不好。进样30 s, 既能保证Glu充分反应,又能保持好的峰形。因此GOD的最佳进样时间选择30 s。

  3.5  分离电压的优化

  分离电压的大小影响自由酶反应器的效率。当固定Glu的浓度为5 mmol/L,GOD浓度为100 U/mL时,改变分离电压,对H2O2的峰电流大小及出峰时间均有影响。由表2可见,随着分离电压的增大,出峰时间变短,提高了自由酶反应器的效率;但观察峰电流大小可发现,当分离电压在600~1000 V时,峰电流呈增大趋势,在1000 V达到最值,分离电压再增大时,峰电流反而降低,并且过高的电压会使分离管道内产生气泡,影响检测基线稳定,最佳分离电压选择1000 V。

  3.6  线性范围和检出限

    由酶反应动力学可知,此Glu自由酶反应器产生H2O2的浓度与GOD及Glu溶液的浓度有关。当GOD浓度一定时,H2O2的浓度与Glu的浓度在一定范围内成正比,即电泳图中H2O2的峰电流与Glu溶液的浓度成正比。由图4可见,H2O2的峰电流与Glu溶液的浓度在0.1~20 mmol/L内呈良好的线性关系,线性方程为Y(nA)=2.27+6.38X(mmo/L), 相关系数r=0.997,检出限为19.8 μmol/L(S/N=3)。
  
  3.7  重现性和稳定性

    采用同一自由酶反应器(5 mmol/L Glu和100 U/mL GOD)在2 h内连续运行10次,测定酶反应的产物峰电流,考察酶反应器的重现性和稳定性。结果显示,峰电流的相对标准偏差(RSD)为2.02%,说明酶反应器的重现性和稳定性良好。

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