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lican8341的博客

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日志

 
 

DNA甲基转移酶3A siRNA 真核表达载体的构建和鉴定  

2015-12-03 21:19:35|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的:构建DNA甲基转移酶3A(DNA methyltransferases 3A,DNMT3A)siRNA重组质粒稳定表达载体,为进一步探讨DNMT3A在多种生物学过程及肿瘤发生发展中的机制提供工具。方法:依据DNMT3A基因的cDNA序列,利用siDESIGN软件获得RNAi靶位点后设计出对应的siRNA寡核苷酸模板,体外合成寡核苷酸片段经退火形成短双链,克隆到真核表达载体pSUPEREGFP1中,构建DNMT3A siRNA重组质粒载体,经酶切鉴定后转染人肝癌细胞系SMMC7721,荧光实时定量PCR初步分析DNMT3A经RNA干涉后的沉默效应。结果:成功构建了靶向DNMT3A基因的siRNA重组稳定表达载体,此载体有效地降低了肝癌细胞系中DNMT3A基因的表达水平。结论:通过该方法初步确定了沉默DNMT3A基因的较佳靶点。

【关键词】  DNA甲基转移酶3A siRNA 载体


    DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰,参与机体的许多生物学过程,如基因转录抑制、基因组印迹、X染色体失活、染色质完整性的维持、细胞分化和发育的调控等[12]。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)催化并维持的。人类的DNMT包括DNMT1、DNMT2、DNMT33个家族,其中DNMT3又分为DNMT3A和DNMT3B,它们同是DNA重新甲基化酶[3]。

    许多研究发现,肿瘤细胞的DNA甲基化模式常发生异常改变,主要表现为基因组的整体低甲基化和局部位点的高甲基化[46]。同时发现 DNMT各成员在多种肿瘤中异常表达,其发生往往先于甲基化模式异常,是肿瘤细胞的一个特征性早期分子改变[710]。

    随着人类表观基因组计划的提出和实施,在各种生物学过程包括肿瘤的发生发展中,DNMT家族不同成员对于甲基化模式建立的确切作用逐渐受到关注[1116],尤其是DNMT3A基因敲除的小鼠对其功能并没有解析[17]。我们利用RNAi技术,构建靶向DNMT3A siRNA真核表达载体,检测是否可降低肝癌细胞系中DNMT3A的表达,以期为进一步研究DNMT3A在多种生物学过程中的功能提供良好的工具。

    1  材料及方法

    1.1  材料

    真核siRNA表达载体pSUPEREGFP1质粒由吴殿青教授(美国耶鲁大学医学院)惠赠,E.coli DH5α购自上海生工生物工程技术服务有限公司,人肝癌细胞系SMMC7721购自上海典型培养物保藏中心,限制性内切酶Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、T4 多聚核苷酸激酶、DNA 连接酶、SYBR premix Ex TaqRM Kit、Trizol RNA分离试剂购自TaKaRa公司,质粒抽提试剂盒、转染试剂LipofectamineTM 2000、RPMI 1640培养基来自Invitrogen公司,凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品,逆转录试剂盒为Promega公司产品,胎牛血清、小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司。引物序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。

    1.2  方法

    1.2.1  DNMT3A靶向siRNA设计与合成  针对人DNMT3A的cDNA 序列(GenBank No.NM_175629.1,NM_153759.2,NM_022552.3),利用Dharmacon公司的在线设计软件siDESIGN(http://www.dharmacon.com/DesignCenter)寻找候选DNMT3A RNAi靶点序列。通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)同源性比对分析其是否具有基因特异性。根据pSUPEREGFP1载体要求设计合成siRNA寡核苷酸模板。寡核苷酸序列由上海申能博彩生物科技有限公司合成。

    1.2.2  构建DNMT3A siRNA的稳定表达载体  将合成的寡核苷酸分别溶解在3.36 μl H2O 中(终浓度为1 mmol·L-1),取 1 μl寡核苷酸,加入48 μl 的退火缓冲液(100 mmol·L-1醋酸钾、2 mmol·L-1醋酸镁、30 mmol·L-1 HEPESKOH,pH 7.4)中,95℃ 5 min后缓慢冷却退火至室温,形成短双链。再与经Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ双酶切的 pSUPEREGFP1载体连接后转化DH5α感受态细胞,挑取卡那霉素(100 μg·ml-1)阳性的克隆,培养后少量抽提重组质粒,经Bgl Ⅱ单酶切和EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定,分别命名为pSUPEREGFP1S3A1、pSUPEREGFP1S3A2、pSUPEREGFP1S3A3。

    1.2.3  细胞培养和重组质粒转染  肝癌细胞系SMMC7721培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基中。转染前1 d,按照2×106瓶-1的浓度在25 ml的细胞培养瓶中接种细胞,过夜培养后细胞汇合率达到70%~80%。

    转染按LipofectinamineTM 2000转染试剂说明书操作。其中脂质体10 μl,重组质粒4 μg。实验对照组分为只加4 μg空载pSUPEREGFP1质粒和不加质粒只加转染试剂的SMMC7721空白组。

    上述转染细胞在37℃、5% CO2培养箱中培养5 h后,加入含20%小牛血清的RPMI 1640培养液1.2 ml,继续培养12 h。换含10%小牛血清的RPMI 1640培养液,继续培养72 h 后,以1∶10的比例将细胞传代于含抗性药物G418(350 μg·ml-1)的RPMI 1640中,进行瞬时表达的检测和稳定表达的筛选。包含各重组质粒和对照质粒的细胞系分别命名为S3A17721、S3A27721、S3A37721、pSUPER7721。

    1.2.4  荧光实时定量PCR分析DNMT3A siRNA载体的沉默效率  各转染细胞系培养至70%~80%汇合时,经Trizol一步法抽提总RNA,取2 μg 总RNA逆转录获得各细胞系cDNA第一链。DNMT3A上游引物5′TATTGATGAGCGCACAAGAGAGC3′,下游引物5′GGGTGTTCCAGGGTAACATTGAG3′,预期扩增片段长度为110 bp[18](只扩增NM_175629.1,NM_153759.2,NM_022552.3,不扩增NM_175630);内参βactin上游引物5′AAAGACCTGTACGCCAACAC3′,下游引物5′GTCATACTCCTGCTTGCTGAT3′,预期扩增片段长度220 bp。 20 μl反应体系包括TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqTM 10  μl、上下游引物( 10 μmol·L-1)各0.5 μl、模板cDNA 1 μl、ddH2O 8 μl。反应条件为95℃ 5 min、95℃ 15 s、65℃ 1 min,共40个循环。

    基因表达的相对定量方法按文献推荐方法[19]操作。以βactin为对照,获得DNMT3A的相对表达差异。每一实验重复3次,每次设置3复孔。

    2  结    果

    2.1  DNMT3A基因候选 siRNA 靶序列的筛选和合成

    利用siDESIGN软件我们获得8条DNMT3A基因候选siRNA靶序列。结合Reynolds等[20]总结的siRNA设计原则和BLAST比对结果,最终筛选出3条候选RNAi靶向序列,每条长度为19 nt,分别命名为S3A1、S3A2和S3A3,均位于DNMT3A mRNA的编码区(表1)。表1  候选siRNA靶序列在DNMT3A基因不同转录本中的位置

    根据pSUPEREGFP1载体要求合成的siRNA寡核苷酸模板长度为64 nt,其中,19 nt与DNMT3A靶基因同源,19 nt与靶序列反义互补,中间相隔9 nt的茎环结构。序列末端含有Bgl Ⅱ、Hind Ⅲ酶切位点残基及作为终止信号的5个胸腺嘧啶等(表2,其中大写部分是RNAi靶点正义序列及其反义互补序列)。

    人类DNMT3A基因有4个mRNA转录本(图1),DNMT3A的甲基转移酶活性主要依靠其羧基端酶催化区6个进化上保守的结构区域完成,DNMT3A第4个转录本丧失该酶催化区,理论上,我们筛选的靶序列不会影响该转录本(NM_175630)的表达水平。

    2.2  DNMT3A的RNAi稳定表达载体的构建与鉴定

    成功插入退火双链的重组质粒由于Bgl  Ⅱ位点被破坏,不能被酶切(图2A)。再用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ双酶切鉴定,若出现291 bp 左右条带(图2B),认为重组成功。

 2.3  DNMT3A siRNA重组质粒载体沉默效率的鉴定

    空载体和各重组质粒转染SMMC7721肝癌细胞系72 h后,荧光显微镜观察瞬时转染效果,成功转染细胞中出现绿色荧光(图3)。G418筛选21 d后获得稳定转染重组质粒的细胞系。采用荧光实时定量PCR测定各重组质粒转染细胞系、对照空载体转染细胞系中DNMT3A mRNA的表达水平。结果显示,与对照组pSUPER7721相比,S3A17721细胞系中DNMT3A mRNA表达量没有显著变化,而S3A27721、S3A37721细胞系中DNMT3A mRNA表达被抑制,沉默效率分别为85%和35%左右(图4)。表2  3对候选的DNMT3A siRNA 寡核苷酸模板

  3  讨    论

    RNAi是一种有效的转录后基因沉默方法,它将与mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞,以使mRNA发生特异性的降解,导致相应的基因沉默[21]。siRNA技术(small interfering RNA)利用21~23 bp短双链RNA特异性地诱导与其有同源序列的mRNA降解,发挥基因沉默的效应,达到类似基因敲除的效果[22]。与其它几种进行功能丧失的技术相比,RNAi 具有明显的优点,它比反义RNA 技术和同源重组技术更有效,更容易产生功能丧失或降低突变,而且与细胞特异性启动子及可诱导系统结合使用时,可以在发育的不同时期或不同器官中有选择地进行基因沉默,同时RNAi还具有投入少、周期短、操作简单等优势,是研究基因功能不可或缺的工具之一[23]。

    RNAi的抑制效率及特异性与靶点序列的选择密切相关。siDESIGN软件筛选候选siRNA靶序列遵循下列基本原则:(1)GC含量在30%~60%;(2)正义链15~19位至少有3个A或U;(3)避免出现反义重复序列;(4)正义链19位为A;(5)正义链3位为A;(6)正义链10位为U;(7)正义链19位非G或C;(8)正义链13位非G。我们据此原则获得8条DNMT3A siRNA候选靶序列,结合siRNA表达载体pSUPEREGFP1的结构特点,并去除与其他基因有同源性的序列后,最终筛选出3条靶序列构建DNMT3A siRNA质粒稳定表达载体。这3条候选靶序列有共同的特点:GC含量在40%~55%;没有4个以上连续的A或T;也没有反向重复序列。我们通过实验验证靶点有效性时发现,其中抑制效率最明显的序列使DNMT3A的表达降低85%左右。据此,我们认为为了提高siRNA的沉默效率,以下原则是比较重要的:选择靶序列要避开5′端或3′端的UTRs;要排除可能形成复杂二级结构的siRNA序列;一定要进行BLAST 筛选排除与其他基因的同源性序列;避免出现连续的多个G或C,GC含量最好在40%~55%。

    在构建重组质粒过程中将64 nt寡核苷酸单链退火形成短双链时,室温自然冷却缓慢退火是载体构建的一个关键,它可以避免单链自身配对形成发夹结构,提高短双链的合成效率。本研究采用pSUPEREGFP1质粒载体制备DNMT3A特异性的siRNA,其优势在于质粒载体导入细胞后相对稳定,能在较长时间有效抑制靶基因。该载体带有新霉素筛选标记,可经G418抗生素筛选获得DNMT3A稳定抑制的细胞系,有利于进行长期的基因功能研究。同时该载体带有增强绿色荧光蛋白基因的编码序列,可实时监测重组质粒载体在细胞内表达和定位的情况。

    本研究成功构建了DNMT3A siRNA 稳定表达载体,并以荧光实时定量PCR鉴定了其在肝癌细胞系中对DNMT3A的抑制效果。DNMT3A siRNA重组载体有效地降解了目的RNA,抑制了细胞系中DNMT3A基因的表达,为研究DNMT3A在诸多生物学过程,尤其是在肿瘤发生发展中的作用提供了一个有效的工具。

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