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日志

 
 

丝氨酸526位点在MEKK3介导的IL 1信号途径中的作用  

2015-03-31 22:37:11|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的:确定MEKK3分子中介导IL1信号途径的关键性氨基酸. 方法:对哺乳动物MEKK3活性环526位点的丝氨酸进行人工诱变后,用瞬时转染的方法分别将526A基因单独及与TRAF6基因同时导入GES1细胞中;用免疫印迹、NFκB 荧光素酶报告基因测定及免疫沉淀实验检测了526A突变体的表达水平、对IL1及TRAF6介导的NFκB基因的表达及MEKK3与TRAF6相互作用的影响. 结果:通过与野生型MEKK3的对比,观察到526A不但阻断了IL1及TRAF6介导的依赖于MEKK3的NFκB基因的激活,同时阻断了TRAF6与MEKK3的相互作用. 结论:526位点的丝氨酸在MEKK3介导的IL1信号途径中起关键性的作用,是不可缺少的关键性氨基酸.  
【关键词】  有丝分裂原激活的蛋白激酶 突变体 TRAF6 NFκB 白细胞介素1 信号传导 
    0  引言 
    有丝分裂原激活的蛋白激酶(Mitogenactivated protein kinase, MAPK)信号转导途径,对细胞的炎症性反应、生长、分化、繁殖和生存等起重要的调控作用[1]. MAPK和ERK的上上级激酶3(MEKK3),是一种丝氨酸/苏氨酸的MAP3K,已被证明不但是TNFα, IL1和LPS诱导的NFκB激活的重要调控激酶[2-3],而且是JNKs的强激活剂[4]. 到目前为止,有关MEKK3在IL1 信号途径中是如何激活的分子机制仍未明了. 最新的研究证明位于MEKK3激活环526位点的丝氨酸残基是TLR诱导的先天性免疫和细胞压力反应的关键性磷酸化调控氨基酸残基[5]. 因此,我们选择526位点的丝氨酸进行研究,旨在为弄清MEKK3在IL1信号转导途径中激活的分子机制奠定基础. 
    1  材料和方法 
    1.1  材料  具有血凝素 (HA)标记基因的MEKK3和具有Flag标记基因的TRAF6哺乳动物表达载体HAtagged SRα3 MEKK3和pcDNA3flagtagged TRAF6由美国Su教授惠赠;NFκB和βactinRenilla荧光素酶报告基因由美国Vaillancourt 教授惠赠. 限制性内切酶Dpn I、真核细胞转染试剂Lipofectamine、抗HA和抗Flag(M2) mAb、重组人IL1β、双重荧光素酶报告测定试剂盒、HRP结合的羊抗鼠IgG二抗、NC膜、化学发光底物、X光片、预染蛋白质标准、DMEM细胞培养液及胎牛血清分别购自New England Biolabs, Invitrogen, Sigma,  Pepro Tech, Promega, Santa Cruz, Amersham Bioscience, KPL, Kodak, Fermentas, Gibco和四季青公司;Orion微板化学发光测定仪为Berthold detection systems产品. 
    1.2  方法 
    1.2.1  526Ser→526Ala人工突变体的制备  MEKK3活性环526位点的丝氨酸突变为丙氨酸的人工突变体526A的制备按美国Stratagene公司提供的QuikChange定点诱变的方法进行:以HAtagged SRα3 MEKK3质粒DNA作为模板,合成1对含诱变位点的互补引物:5′cagaccatctgcatggcagggacaggcattc3′和5′gaatgcctgtccctgccatgcagatggtctg3′(划线部分为诱变位点的丙氨酸密码子),用Pfu DNA聚合酶进行快速PCR定点诱变. PCR条件:95℃ 30 s后,按95℃ 30 s,55℃ 1 min和68℃ 12 min顺序,共25循环. 诱变产物经DpnI在37℃作用1 h,酶切除去野生型的模板DNA后,直接转化入E.coli XL1Blue感受态细胞,获得的人工突变体526A质粒DNA送公司测序鉴定. 
    1.2.2  细胞培养和瞬时转染或共转染实验  在37℃含有50 mL/L的CO2的培养箱中,用含100 mL/L的胎牛血清的DMEM细胞培养液培养人胃黏膜GES1细胞. 在瞬时转染前24 h,对GES1细胞进行定量培养,用Lipofectamine按制造商提供的方法及用量,将质粒DNA转染入GES1细胞中,并设不含质粒DNA的对照管. 共转染除了必须同时将等量的两种或三种或四种DNA在同一试管内混合外,其余方法同上. 
    1.2.3  Western Blot测定  细胞裂解液的制备方法同免疫沉淀法,测定方法与我们先前报道的一致[3],所用的SDSPAGE胶浓度为120 mL/L,所用的抗HA及抗Flag 1抗的稀释度分别为1∶1000及1∶500;2抗的稀释度为1∶5000,最后用化学发光底物检测膜上的抗原抗体复合物,通过X光片显示结果. 
    1.2.4  NFκB荧光素酶报告基因测定  分别将NFκB荧光素酶报告基因与MEKK3或526A进行共转染、或分别将NFκB报告基因与MEKK3+TRAF6或526A+TRAF6共转染入GES1细胞内,同时转染入GES1细胞的还有βactin renilla荧光素酶DNA作为转染效率的控制,用双重荧光素酶报告基因测定试剂盒按说明进行相对荧光素酶活性测定. 在转染质粒DNA后24 h, 用终浓度为10 μg/L的IL1刺激GES1细胞12 h后,进行NFκB荧光素酶报告基因测定. 
    1.2.5  免疫沉淀测定  在GES1细胞转染HA或Flag或同时共转染这两种基因标记的不同表达载体36 h后,用低盐裂解液裂解GES1细胞,0.6 mL/每孔(6孔板). 每样本取0.4 mL裂解液与抗体反应4 h后,加入蛋白A琼脂糖珠继续反应1 h以沉淀表达的蛋白抗体复合物. (同时取20μL的样本进行免疫印迹测定,以验证目的蛋白的表达. )用同样的裂解液洗蛋白A琼脂糖珠4次,最后用1×SDSPAGE 上样缓冲液将表达的蛋白抗体复合物自蛋白A琼脂糖珠上洗脱下来后,加样于SDSPAGE胶上,进行与方法1.2.3相同的Western Blot 测定,以获得结果. 
    2  结果 
    2.1  526A人工突变体序列的鉴定及526A的表达  序列测定表明MEKK3 526位的碱基序列已由原来编码丝氨酸的tca成功地改变为编码丙氨酸的gca. 在GES1细胞转染了526A质粒DNA 36 h后,用Western Blot方法检测了526A的表达:当用抗HA 抗体与转到NC膜上的526A表达的蛋白质反应时,可见一条Mr约74×103的526A特异表达的+HA标记基因表达的融合蛋白质条带,与理论计算的MEKK3活性环526位点的丝氨酸突变为丙氨酸的人工突变体526A 的分子质量相符. 
    1:未转染时的阴性对照;2:526A;3:转染了野生型HAMEKK3的对照. 
    图1  Western Blot测定526A人工突变体在GES1细胞中的表达 
    2.2  526A阻断了TRAF6介导的依赖于MEKK3的NFκB报告基因的表达  当GES1细胞转染了TRAF6或TRAF6+MEKK3时,检测到了强的NFκB报告基因的活性,表明过表达的MEKK3增加了TRAF6介导的NFκB 荧光素酶报告基因的表达(图2);当GES1细胞共转染了TRAF6+526A基因时,仅检测到较弱的NFκB荧光素酶报告基因的活性,表明526A阻断了TRAF6介导的NFκB基因的表达(图2). 
    图2  526A阻断了TRAF6介导的依赖于MEKK3的NFκB报告基因的活性 
    2.3  526A阻断了IL1介导的依赖于MEKK3的NFκB报告基因的表达  当未转染或转染了野生型的MEKK3的GES1 细胞分别接受IL1刺激后,通过荧光素酶报告基因的测定,检测到了强的NFκB报告基因的活性,表明过表达的MEKK3增加了IL1介导的NFκB基因的表达(图3A);当GES1细胞转染了526A后再接受IL1的刺激,仅检测到了较弱的NFκB荧光素酶报告基因的活性,说明526A阻断了 IL1 介导的NFκB基因的表达(图3A);越多的526A基因转染入GES1细胞中,检测到越低的NFκB荧光素酶活性(图3B), 表明526A的阻断作用具有高度特异性. 
 图3  526A阻断了IL1介导的依赖于MEKK3的NFκB报告基因的活性 
    2.4  526A使MEKK3丧失了与TRAF6相互作用的能力  结果显示,当526A与TRAF6同时共转染入GES1细胞中后,用免疫沉淀法沉淀526A后,再用抗Flag抗体检测沉淀物中的TRAF6时,未能检测到TRAF6 (图4);接着,用抗Flag抗体免疫沉淀TRAF6,用抗HA抗体进行Westernblot分析,也未能检测到526A(图4),说明526A不能与TRAF6发生相互作用,因此无526ATRAF6的复合物存在;而作为对照, HAMEKK3与FlagTRAF6则可发生相互作用形成MEKK3TRAF6复合物,可被免疫沉淀法所检测 (图5). 
    图4  HA标记的526A单独、或与Flag标记的TRAF6表达载体同时转染入GES1细胞中 
    3  讨论 
    许多研究已明确地证明TRAF6是IL1信号途径中的三种最关键的信号分子之一[6-7]、NFκB基因的表达是能证明TRAF6在IL1信号转导途径中发挥作用的最好方式[8];同时还证明MEKK3在NFκB和IL1信号途径中起重要作用[2,5]. 因此,我们选择TRAF6作为本研究的关键成分之一、NFκB 报告基因表达的测定作为基本的方法进行526位点的丝氨酸在MEKK3介导的IL1信号途径中作用的研究. 
    活性形式的MEKK3能引起TRAF6介导的NFκB基因的表达增强,526 A的表达降低了TRAF6介导的NFκB 报告基因的表达, 证明了丝氨酸526 在MEKK3 参与的TRAF6介导的NFκB基因的表达中起关键性作用. 
    IL1不但能激活未转染的GES1细胞中NFκB基因的活性(含有内源性的MEKK3,几乎所有的真核细胞自身都能产生),而且能增加转染了活性形式的MEKK3基因的GES1细胞的NFκB基因的表达,表明过表达的MEKK3可增加IL1介导的NFκB基因的表达;在526A基因转染入GES1细胞中后,当接受IL1刺激时,GES1细胞的NFκB基因的表达水平降低;而且526A基因转染入GES1 细胞中越多,NFκB基因的表达降低的也越多,说明526A阻断IL1介导的NFκB 基因的激活具有很强的特异性. 我们的结果证明了MEKK3活性环的526位点的丝氨酸在IL1介导的NFκB基因活化中起决定性作用. 
    在本研究中,我们应用高特异性的抗HA和抗Flag抗体,测定融合蛋白质HAMEKK3或HA526A和FlagTRAF6, 先前的研究已证明这是一种研究蛋白质分子之间相互作用的可靠的方法. 通过共转染试验,我们发现野生型的MEKK3(活性形式的MEKK3),能与TRAF6相互作用,形成MEKK3TRAF6复合物;而526A不能与TRAF6相互作用,不能形成MEKK3TRAF6复合物,表明当526位点的丝氨酸被丙氨酸替代后,完全破坏了MEKK3与TRAF6相互作用的能力. 因此,可以推测MEKK3在IL1信号途径中的激活机制可能是因为MEKK3与TRAF6相互作用形成了MEKK3TRAF6复合物导致了MEKK3自我磷酸化而激活. 最新的有关MEKK3激活机制的研究表明,当缺乏上游的激活激酶时,MEKK3可通过其分子中的催化功能域形成二聚体而自我磷酸化和自我激活[5,9]. 由于TRAF6不是蛋白激酶,只是一种接头蛋白质,因此MEKK3与TRAF6相互作用形成了TRAF6MEKK3复合物后而激活可能是因为自我磷酸化. 在MAPK信号转导途径中,蛋白质磷酸化是信号分子激活的根本. 我们的结果提示MEKK3活性环的526位点的丝氨酸被丙氨酸替代后导致了MEKK3失去了自我磷酸化的能力因此使MEKK3丧失了被激活的能力. 
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