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中华按蚊多态微卫星DNA位点的筛选和特征研究  

2015-03-31 22:38:43|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 对中华按蚊多态的微卫星DNA位点进行分离和筛选,并阐明其特征. 方法: 应用中华按蚊基因组DNA的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针杂交,亲合素富集和超滤离心浓缩目的片段,扩增放大,克隆并测序,构建中华按蚊微卫星DNA库. 在其中挑选合适的微卫星位点,建立扩增体系. 应用中华按蚊现场样本扩增不同的微卫星位点,聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选具有多态性的微卫星位点. 结果: 构建的中华按蚊微卫星DNA库中包含252条序列,GenBank注册登记号为EF620047~EF620298. 其中,双核苷酸重复最为常见,三核苷酸重复次之,多核苷酸重复少见;含(CA)和(GT)重复的序列最多,重复次数最多可达56次;完整序列占35.3%,非完整序列占20.2%,复合序列占18.7%,其余为非典型序列. 设计了22对引物扩增不同的微卫星位点,其中20个位点产生特异的PCR产物,PAGE结果显示其中15个位点具有多态性. 结论: 获得了中华按蚊新的多态微卫星位点共15个,为中华按蚊群体遗传和其他相关研究提供了分子标志.  
【关键词】  中华按蚊;微卫星DNA 
    0引言 
    微卫星DNA是一类简单的短核苷酸串联重复序列,又称简单重复序列,广泛分布于真核生物的基因组中,每间隔10~50 kb即存在一个微卫星DNA. 微卫星DNA包括核心序列和两侧的侧翼序列,通常核心序列重复单元长1~6 bp,重复次数为10~60次,其重复次数的差异导致微卫星DNA具丰富的长度多态性[1-2]. 微卫星DNA已经广泛应用于研究生物多样性、群体遗传结构、行为生态和亲缘关系等[3],是一种理想的的分子标志. 中华按蚊(Anopheles sinensis Wiedemann, 1828)在我国分布广且种群数量大,是以往文献记载中疟疾和丝虫病的重要传播媒介[4-5]. 本研究拟构建中华按蚊的微卫星DNA库并筛选其中多态的微卫星位点,为中华按蚊基因组学研究积累基础资料,并为其相关研究提供新的分子标志. 
    1材料和方法 
    1.1材料构建中华按蚊微卫星DNA库的样本为上海实验室品系,由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供. 现场中华按蚊采自云南思茅(200508,n=10)、云南盐津(200607,n=10)和湖北武汉(200607,n=10),选择雌性成虫为实验材料. 
    1.2方法 
    1.2.1微卫星DNA库构建基因组DNA的抽提参照Hammond等的文献进行[6],-20℃保存待用. 基因组DNA经Sau3AI酶切,回收200~800 bp的片段,加SAUL接头连接,接头序列如下:SAULA:GCGGTACCCGGGAAGCTTGG,SAULB:GATCCCAAGCTTCCGGGTACCGC. 以SAULA为引物,连接产物作为模板PCR扩增,反应液中含PCR缓冲液、2.5 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP,0.8 μmol/L引物,0.6 U Taq 酶(上海生工生物工程有限公司)和2 μL模板,在热循环仪(PTC100,美国ABI公司)上执行如下程序:72℃ 5 min后,94℃ 1 min,67℃ 1 min和72℃ 2 min共32个循环,72℃延伸5 min. 将扩增产物变性后,与Biotin16dd UTP(瑞士Roche公司)标记的寡核苷酸探针杂交,探针包括:(AAT)17,(GA)25,(CCT)17,(AC)25,(CAG)17,(CAC)5,(TC)10,(GT)8和(TG)18. 用亲和素Vectrex Avidin D(英国Vector Labs公司)捕获并超滤离心(美国Millipore公司)浓缩富集杂交的目的片段. 以富集的核酸作为模板,SAULA为引物扩增,反应体系和程序同前. 随后,用PCR产物再次杂交、捕获、浓缩富集和扩增. 将上述扩增产物插入TOPOT载体(美国Invitrogene公司),转化E.coli JM109,挑选含微卫星DNA序列的阳性克隆,用四色荧光标记双脱氧链终止法测序(PEABI3770全自动测序仪,上海英骏生物技术有限公司),应用BioEdit(Version 5.0.9)软件包分析所获序列. 
    1.2.2微卫星DNA多态位点筛选单蚊抽提现场中华按蚊基因组DNA,参照文献进行分子鉴别确认蚊种为中华按蚊[7]. 选择22条重复次数较多,且典型的微卫星DNA序列,应用Primer 3(Version 3.1)软件包设计引物. 以单蚊基因组DNA为模板,PCR扩增微卫星DNA(反应体系和程序同前),退火温度范围在55℃~60℃. 扩增产物经5%聚丙烯酰胺凝胶电泳后,银染、显色,依据凝胶上的条带判断其是否具有多态性. 
    2结果 
    2.1中华按蚊微卫星DNA库构建的中华按蚊微卫星DNA库中包含282条序列,其中18条序列完全相同,21条序列较短(小于100 bp),故有效的微卫星DNA序列共252条,GenBank注册号为EF620047~EF620298. 分析所获的微卫星DNA序列,显示其长度范围为50~800 bp,大多数在300 bp左右. 就重复情形而言,双核苷酸重复最为常见,三核苷酸重复次之,多核苷酸重复少见;含(CA)和(GT)重复的序列最多,重复次数不等,最多可达56次. 所获的微卫星DNA依据文献[8]标准划分,结果完整序列为89条(35.3%),非完整序列51条(20.2%),复合序列47条(18.7%),其余为非典型序列(25.8%). 
    2.2中华按蚊微卫星多态位点设计并合成了22对扩增微卫星DNA的引物,对现场样本进行扩增的结果显示,20个位点有特异的PCR产物,经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(一条带为纯合子,两条带以上为杂合子),共有15个微卫星DNA位点具有多态性(表1). 本研究的多态微卫星位点在退火温度为55℃时,均存在特异产物.  表1中华按蚊多态的15个微卫星位点特征 
    3讨论 
    通过比较分析本研究所获中华按蚊微卫星DNA序列的特点,发现与已报告的冈比亚按蚊(An. gambiae)[9-10],催命按蚊(An. funestus)[11-12]和穆歇按蚊(An. moucheti)[13]等相似,均为双核苷酸重复最常见,三核苷酸重复次之,多核苷酸重复少见. 韩国学者Jung等[14]应用(GA)22和(CA)22寡核苷酸探针分离和筛选了韩国的中华按蚊微卫星DNA阳性克隆48个,与之比较,本研究应用了更多的探针,特别是三碱基重复序列的探针,分离的我国中华按蚊微卫星DNA序列,不仅重复单元序列多样化,而且序列的数量也较多,更具广泛性,极大地丰富了中华按蚊的微卫星DNA序列数据库.
通常一个理想的微卫星DNA标志应具备完整的重复序列,有相当长度的侧翼区(至少15 bp)以适合引物设计的需要. 本研究分离的中华按蚊微卫星DNA序列中,绝大部分的侧翼区有足够的长度可供引物设计. 笔者在检测的22个微卫星位点中,获得了15个具有多态性,提示中华按蚊微卫星位点的多态性比例较高,为68.2%(15/20),结果与文献报告的相似,如:韩国的中华按蚊为64.7%(11/17)[14],催命按蚊为57.4%(27/47)[11]和环跗库蚊(Culex tarsalis)为60.0%(12/20) [15]. 
    本研究中华按蚊的多态微卫星位点中等位基因数从2到12不等(未发表资料)也与文献报告的相当[11, 14-15],筛选得到的中华按蚊多态微卫星位点为首次报道. 
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