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日志

 
 

铜化合物水解肌红蛋白活性位点的质谱研究  

2015-03-31 22:43:23|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  以铜化合物为金属模拟酶,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳研究它们对肌红蛋白的水解作用,利用高效液相色谱电喷雾质谱的测量方法替代传统的N端氨基酸序列分析结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱或电喷雾质谱方法来检测得到的多肽片断分子量,据此确定水解反应的活性位点。结果得到分子量为10093.0,10388.0,6876.0和6581.0的4个片段,分别对应于Gly191,Gly1Ala94,Ser92Gly153和Thr95Gly153, 表明Cu2+通过与肌红蛋白中His93的侧链配位,水解断裂位于其前后沿的第2个肽键,即:Gln91Ser92和Ala94Thr95,水解反应具有很高的选择性。位于His93前沿的活性位点特征与过去的研究结果一致,而His93后沿的活性位点,即His93Ala94Thr95序列中Thr95 N端是一个新位点。

【关键词】  铜,肌红蛋白,高效液相色谱电喷雾质谱联用,水解作用

  1 引 言

  多肽和蛋白的水解是化学和生物化学过程中最为重要的反应之一,也是研究分析生物化学以及蛋白质结构与功能的最重要任务之一。蛋白的序列分析、蛋白结构与功能研究、蛋白质与核酸的相互作用以及新型化学治疗药物的合成等方面均涉及此类反应。目前, 可用于促进多肽和蛋白水解多采用蛋白水解酶,它们能水解诸如磷酯、蛋白质和DNA这类大分子。但这些酶为数甚少,远远不能满足蛋白质结构与功能以及工程学研究的需要, 而且这类生物化学试剂制备困难、价格昂贵。因此, 人们一直在探求能够替代或补充这类水解酶的化学试剂。由于某些肽酶是以金属离子为活性中心的,因此, 长期以来人们把一些金属化合物作为金属肽酶模拟物加以研究。早期工作大多集中在研究酰胺化合物中酰胺键断裂的结构要求及其机理,自20世纪90年代起才在小肽和蛋白质肽键的水解方面取得突破性进展。所采用的金属元素也日趋多样,其中包括Co[1],Ni [2],Cu[3~5],Pt[6]和Pd[7,8]等,研究的对象也从小肽发展到直接使用天然蛋白或基因工程产生的蛋白质[9~11]。

  Cu2+是一种具有人工金属酶活性的过渡金属离子,可以选择性地水解断裂多肽和蛋白。但要使Cu2+成为分析生物化学和蛋白工程中被广泛接受和采用的试剂,还需要对不同蛋白进行一系列的实验,来确定其水解效率、选择性和其它相关性质。在生物体系中具有储存和运输氧功能的肌红蛋白(Mb),其大小中等,结构信息已知,非常适用于研究过渡金属化合物对蛋白的水解作用。本研究采用Cu2+化合物对马心肌红蛋白进行水解切割研究。实验表明,Cu2+化合物对肌红蛋白的水解具有很高的选择性,并发现一个在Cu2+化合物水解多肽及蛋白的研究中从未观察到的新的水解位点。

  2 实验部分

  2.1 仪器与试剂

  LCQ电喷雾质谱仪(Finnigan MAT); MiniProtean Ⅱ电泳仪(BioRad);UV 3100紫外可见分光光度计(Shmidzu);UVP White/Ultraviolet 瞬变显示光密度计;pHS3C pH计。马心肌红蛋白(Sigma公司)、乙腈和三氟乙酸为色谱级,其它试剂均为分析纯。

  2.2 蛋白的水解反应

  肌红蛋白溶于二次蒸馏水后,取上清液备用,其浓度通过在557 nm处测其UVVis谱确定(ε557=13.8 L/(mol·cm)[12]。将铜化合物和肌红蛋白按Cu∶Mb=5∶1(摩尔比)的比例混合, 在50 ℃ 下恒温3 d,然后加入EDTA溶液终止反应。反应终止后加入360 μL标准SDS还原缓冲溶液,将混合物在95 ℃恒温5 min,然后再冷却到室温,取5 μL在BioRad MiniProtein 电泳仪上进行聚丙烯酰胺电泳。分离胶:pH 8.8,18%聚丙烯酰胺;浓缩胶:pH 8.6,7%聚丙烯酰胺。用0.1%考马斯蓝R250染色。

  2.3 色谱质谱条件

  Hypersil C8柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm),流速0.2 mL/min。洗脱液A:含0.1%三氟乙酸的水溶液;洗脱液B:含0.1%三氟乙酸的乙腈溶液。洗脱梯度为60 min内从100%A到40%A+60%B。ESI离子源喷雾电压4.5 kV,毛细管温度250 ℃。ESIMS测得的原始数据通过Bioexplore软件计算蛋白和多肽片断的分子量。

  3 结果与讨论

  3.1 铜化合物对蛋白的水解作用

  将肌红蛋白按实验方法分别与CuCl2,Cu(ClO4)2和Cu(AC)2在50 ℃下恒温反应3 d,聚丙烯酰胺凝胶电泳如图1。

  图1中第1列为分子量标记,第2列是控制实验,即肌红蛋白中未加任何铜化合物,在此条件下肌红蛋白未见任何断裂现象。这表明水解反应确实是由铜化合物引起的。图1中3~5列除可观察到2个主要的片断带外,还隐约可见2个较弱的片断带。经HPLCESIMS实验证明,2个较强片断带之间以及2个较弱片断带之间互为补偿带。

  从图1还可见,在完整蛋白带下还存在一条较浅的带,即使在新鲜配制的肌红蛋白的凝胶电泳中,这一浅带仍然存在,这是由于肌红蛋白中含有少量杂质引起的,而不是其骨架水解断裂的产物。在研究钯配合物对肌红蛋白的水解工作中也观察到了这个对应于蛋白杂质的凝胶电泳带[10] 。

 3.2 肌红蛋白的质谱研究

  图2a为肌红蛋白的原始质谱图,图2b通过仪器自带的Bioexplore软件计算出的蛋白分子量。由于肌红蛋白中的血红素与其多肽骨架仅以His93与Fe2+轴向配位并以弱的氢键作用相结合,它在蛋白的水解反应或ESIMS离子源较高的界面势能中都很易失去。采用质谱检测到的肌红蛋白的分子量都是去辅基肌红蛋白的分子量Mr=16951.0,与理论计算的去辅基肌红蛋白分子量16951.5十分接近,进一步证明了电喷雾质谱在生物大分子的分子量测定方面具有极高的可信度。

  3.3 水解位点的确定

  在蛋白质和多肽化学水解的研究中,反应产生的多肽片断通常是由N端氨基酸序列分析结合MALDITOF或ESIMS来确定的。本研究采用HPLCESIMS确定水解位点。肌红蛋白与铜化合物反应终止后注入HPLC柱分离,分离后的样品直接进入与分离柱相连的ESIMS检测分析。测得的多肽片断分子量分别为10093.0和10388.0(图3a)以及6876.0和6581.0(图3b)。从得到的片断分子量发现,图3中分别有2个片断分子量之和恰好等于去辅基肌红蛋白的分子量加上1个水分子的分子量(10093+6876=16951+18,10388+6581=16951+18)。这表明,图1中强度较强的片断即分子量为10093和6876的片断之间以及强度较弱的片断即分子量为10388和6581的片断之间互为补偿带,分别对应于Gly1Gln91和Ser92Gly153以及Gly1Ala94和Thr95Gly153的肌红蛋白多肽片断的分子量。由HPLCESIMS测得的多肽片断分子量与通过Paws软件计算的相应片断分子量的值分别列于表1。表1 水解所得多肽片断的实验值和理论值

  Table 1 Experimental and theoretical molecular masses of fragments from hydrolyzation方法 MethodGly1Gln91Ser92Gly153Gly1Ala94Thr95Gly153HPLCESIMS10093.006876.0010388.006581.00Paws计算值 Calculated10092.586876.8910387.876581.59 由表1可见,实验值和理论计算值非常吻合,再次证明电喷雾质谱对蛋白和多肽分子质量的测量有着良好的精确度。图3中还出现了1个分子量为8477.0的峰,此峰是完整肌红蛋白的二价离子峰,此峰在完整肌红蛋白的ESIMS中也可观察到(图2b)。这一峰值的出现表明,在HPLC条件下水解产生的多肽片断和完整蛋白未能完全分离,而电喷雾质谱仍能分别将它们检出,这是对ESIMS高分辨能力的又一有力证明。

  3.4 水解反应的活性位点

  在多肽及蛋白水解反应中,被Cu2+水解的多肽和蛋白都有一个共同的特征,即都含有ThrHis或SerHis的氨基酸序列,且Cu2+都是与组氨酸的侧链配位,只有直接位于SerHis或ThrHis前沿的肽键对水解反应才灵敏。去辅基肌红蛋白由153个氨基酸残基组成,其中有11个组氨酸,它们都是Cu2+的可能配位点。本实验中还未发现Cu2+与His93以外的组氨酸配位从而引起相邻肽键断裂的迹象。而肌红蛋白氨基酸序列中只有His93才与Ser或Thr 相邻,即……Gln91Ser92His93Ala94Thr95Lys96……。本实验中,铜化合物与肌红蛋白产生的水解反应出现了2个断裂点:His93前沿的Gln91Ser92,His93后沿的Ala94Thr95。前者与文献[2]报道的Cu2+对蛋白水解反应的特征相符,后者是本研究中观察到的Cu2+离子水解反应的一个新的活性位点。Gln91Ser92位点的断裂对应于图1中2个较强的片断带,Ala94Thr95位点的断裂则对应于图1中2个较弱的片断带。

  肌红蛋白中His93与其辅基血红素中Fe2+轴向配位,要使Cu2+与His93配位,先将His93与Fe2+解配。无论血红素解配还是Cu2+配体进入血红素空腔都要克服空间位阻、极化效应等障碍,故Cu2+与His93配位比与肌红蛋白中其它组氨酸配位都更困难。但是,在它与肌红蛋白的水解作用中仅出现His93前后沿的肽键断裂。这说明Cu2+对蛋白质的水解具有非常高的选择性。

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