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lican8341的博客

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日志

 
 

人类免疫缺陷病毒-1 nef诱导凋亡及下调人类白细胞抗原-I类分子  

2015-04-21 21:51:33|  分类: 人类对抗艾滋病新 |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  【目的】 研究人类免疫缺陷病毒(HIV)-1 nef 调节细胞表面的人类白细胞抗原(HLA)-I类分子及诱导细胞凋亡情况。【方法】 将293T细胞分为两组,用脂质体法将含HIV-1 nef基因的质粒及空载体分别转染细胞,Western blot检测HIV-1 nef在转染细胞中的表达,荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-I类分子表达及细胞凋亡情况。【结果】 HIV-1 nef在转染细胞中有表达。转染HIV-1 nef的细胞与转染空载体的细胞经抗HLA-A,B,C-FITC染色后,平均荧光强度分别为205±22及269±15,两者相比有显著性差异(P< 0.01); 经Annexin V-APC/PI染色后,阳性细胞百分率分别为(60.82±8.32)%及(8.12±5.43)%,两者相比亦有显著性差异(P< 0.01)。【结论】 HIV-1 nef下调细胞表面的HLA-I类分子及诱导细胞凋亡。

【关键词】  人类免疫缺陷病毒-1 nef; 人类白细胞抗原-I类分子; 凋亡; 转染

    人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)是引起艾滋病即获得性免疫缺陷综合症的病原体。HIV 主要型别分为HIV-1和HIV-2,我国艾滋病大多由HIV-1引起,一些逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂,融合抑制剂及某些中药[1]等均具有抗HIV-1的作用。在HIV-1感染的患者中,疾病的进展与凋亡,特别是辅助性 T细胞的凋亡呈负相关。大量研究表明,HIV-1的附属蛋白Tat,Vpr,Vpu及Nef 参与调节细胞的凋亡[2]。其中,HIV-1 nef 参与调节细胞的凋亡颇受重视。目前一致认为,HIV-1 nef能够诱导旁观者细胞的凋亡[3,4],而对HIV-1感染或转染HIV-1 nef 的细胞,多数学者认为HIV-1 nef 抑制该细胞的凋亡[3,5-8],而少数学者则得出相反的结论[9,10]。因此,对HIV-1感染或转染HIV-1 nef 的细胞,HIV-1 nef 是促进或抑制其凋亡,尚需进一步研究。此外,有报告显示HIV-1 通过其nef 下调细胞表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) I类分子而逃避宿主细胞毒T细胞(cytotoxic T cell, CTL)的攻击而保护感染细胞[11]。由于细胞凋亡是程序性细胞死亡,而HIV-1 nef 下调细胞表面的MHC I类分子意味着这种HIV-1 蛋白保护感染细胞免受死亡。从导致死亡的角度来说,细胞凋亡和细胞表面MHC I类分子的下调互为矛盾。对于转染HIV-1 nef 的细胞,是否同时具备细胞凋亡及细胞表面MHC I类分子下调的特性,本文作一定的分析。

    1   材料和方法

    1.1   材料

    SVCMV 载体及SVCMV nef质粒为加拿大Manitoba大学Xiaojian Yao教授所赠。脂质体LipofecfamineTM 2000购自Invitrogen,抗HIV-1 nef抗体购自Santa Cruz公司,辣根过氧化物酶标记的马抗山羊IgG购自北京鼎国生物技术有限公司,化学发光底物Supersignal West Pico Kits 购自Pierce公司,PVDF膜购自Roche公司,RIPA buffer 购自Sigma公司,抗人HLA-A,B,C-FITC单克隆抗体及膜联蛋白(Annexin V)-APC均购自BD公司,DMEM及胎牛血清(FBS)均购自GIBCO公司,FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。293T细胞为本实验室自备。

    1.2   细胞培养和转染 

    以含10%FBS和DMEM培养293T细胞。DNA的脂质体转染法按Lipofectamine TM 2000的说明书所示进行操作,即:①在转染前一天铺细胞,注意每盘细胞中所放置的细胞的数量要相等,所加培养液的量要一致。转染时细胞达覆盖生长面的50%~70%,②准备A液(脂质体+无血清的DMEM,两者比例为10 μL ∶ 250 μL)及B液(DNA+无血清DMEM,两者比例为4 μg : 250 μL)分别混匀后室温下静置5 min,然后混合A液与B液,室温下静置20 min,其中,DNA与脂质体的比例为4 μg : 10 μL;④将待转染细胞的培养液换为无血清DMEM,吸取A,B混合液,逐滴滴入含待转细胞的培养液中,注意每盘细胞中所加的DNA量要相同。4 ~ 6 h后,以含10%FBS的DMEM换液。转染48 h收集、计数细胞,取3×106细胞作Western blot,取0.5×106 细胞作流式细胞术分析。

    1.3   Western blot 测定HIV-1 nef的表达

    收集转染48 h的细胞离心(120 × g, 5 min),吸弃上清液,加入40 μL RIPA butter,混匀后置冰上,30 min后,4 ℃离心(13 400 × g, 20 min),取上清液,加入点样缓冲液,沸水浴5 min,点样,样品在含12.5%的聚内烯酰胺(PAGE)凝胶中电泳。电泳后将PAGE凝胶中的蛋白通过电转移槽转至PVDF膜。用3%的脱脂乳封闭已转PVDF膜2 h,继后加入一抗anti-HIV nef (PBS 1∶ 400稀释),4 ℃封闭过夜后,用PBS洗膜5次,每次5 ~10 min。洗膜后加入二抗辣根过氧化物酶标记的马抗出羊IgG(PBS 1 ∶ 500稀释),室温下缓慢振荡1 h,再用PBS洗膜5次,每次5 ~10 min,最后用化学发光试剂盒显色、曝光,对HIV-1 nef的表达进行检测。

    1.4   荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA-A,B,C分子及测定细胞凋亡

    取转染48 h细胞, 离心(300 × g,5 min),弃上清液,PBS洗涤细胞后再离心,去掉上清液。若检测细胞表面的HLA-A,B,C分子的表达,将细胞重悬于300 ?滋L PBS中,加入抗人HLA-A,B,C-FITC 1.0 ?滋g,混匀后室温避光静置25 min,PBS洗涤一次,弃上清,将细胞重悬于300 ?滋L PBS中,立即上机检测;若测定细胞凋亡,将细胞重悬于300 ?滋L染料结合缓冲液中,振荡混匀,加入5 ?滋L Annexin V-APC,混匀后室温避光静置15 min,然后,加入5 ?滋L的PI,混匀后再作用5 min,立即上机检测。全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取并分析。FITC为荧光1(FL1),PI为荧光2(FL2),APC为荧光4(FL4)。

    1.5   统计学方法

    实验结果用统计软件包SPSS 10.0进行处理,数据以x±s表示,多组间相比采用One way-ANOVA,两组间比较用t检验。

 2   结   果

    2.1   HIV-1 nef目的基因的鉴定

    扩增并抽提质粒SVCMV及SVCMV nef。DNA电泳结果显示质粒SVCMV nef 较SVCMV大(图1)。同时,将SVCMV nef送去测序,测序结果显示,目的基因HIV-1 nef序列正确。

    2.2   Western blot 鉴定HIV-1 nef 的表达

    转染48 h的293T细胞,经SDS-PAGE凝胶电泳、转膜后,以1 ∶ 400稀释的抗HIV-1 nef抗体进行标记,化学发光试剂盒显色、曝光,对HIV-1 nef的表达进行 检测。结果示转染SVCNV的细胞,无蛋白条带,而转染SVCMV nef的细胞,可见分子量为27 ku的蛋白条带(图2)。本试验重复3次,结果一致,列出其中一次结果(下同)。

    2.3   流式细胞仪测定细胞表面的HLA-A,B,C分子及细胞凋亡

    空载体或HIV-1 nef 转染48 h的细胞,经抗人HLA-A,B,C-FITC染色后用流式细胞仪分析,结果显示,细胞表面HLA-A,B,C分子的阳性率分别为(95.40±2.24)%及(93.60±2.93)%,两者相比无显著性差异(t=8.69, P > 0.01),而两种转染细胞的平均荧光强度分别为269±15及205±22, 两者相比有显著性差异(t=11.26, P< 0.01,图3A)。转染48 h的293T细胞,用Annexin V-APC/PI染色后,经流式细胞仪检测,结果显示SVCM或SVCMVnef转染的细胞,Annexin V+PI-细胞所占的百分比分别为(8.12±5.43)%及(60.82±8.32)%,两者相比有显著性差异(t=-8.21, P< 0.01,图3 B)。        

    3   讨   论

    3.1   HIV-1 nef 下调MHC I类分子的表达

    机体要产生针对HIV-1 及其它病毒感染的适应性免疫应答,需要一定数量的组织相容性复合物I类分子来递呈感染细胞表面的病毒抗原。CTL通过识别MHC I类分子递呈的抗原肽,杀伤感染细胞。然而,病毒通过下调感染细胞表面MHC I类分子的表达而逃避宿主CTL的杀伤 。研究发现,HIV-1是通过其nef 下调细胞表面的MHC I类分子[11]。HIV-1 nef 下调MHC I类分子的能力与HIV-1的进程相关。来自疾病进展缓慢者HIV-1 nef下调MHC I类分子的能力较弱,而来自病程进展迅速者的HIV-1 nef下调MHC I类分子较为明显[12]。因此,研究HIV-1 nef下调MHC I分子有着重要的意义。本实验结果表明,HIV-1 nef转染的细胞与空载体转染的细胞比较,细胞表面的HLA-I类分子明显下调(P< 0.01)。既往的报告亦得出类似的结论[11]。因此,HIV-1 nef下调转染或感染细胞表面的MHC I类分子是确定的。由于MHC I类分子下调,转染HIV-1 nef的细胞不能有效地被CTL识别而受到保护。因CTL杀伤靶细胞需启用两种机制:细胞裂解及细胞凋亡,故推测HIV-1 nef具有保护转染或感染细胞免受凋亡的特性。

    3.2   HIV-1 nef调节细胞的凋亡 

    本文资料说明,转染HIV-1 nef的细胞较空载体转染的细胞更易发生凋亡。这与Lee等[9,10]的研究结果一致。有关HIV-1 nef 调节转染或感染含其相应基因的细胞的凋亡情况,报道颇有争议。部分学者认为HIV-1 nef可作用于细胞信号通路而抑制细胞的凋亡,其中的机制包括:①HIV-1 nef抑制凋亡信号调节酶(ASK1)。ASK1系Fas和肿瘤坏死因子α(TNF-α)死亡信号通路中的关键酶 。HIV-1 nef通过抑制该酶而抑制Fas和TNF-α介导的凋亡[3]。②活化P21-活化激酶(PAK)。HIV-1 nef结合并活化PAK上游的磷酸甘油3-激酶(PI3K),进而激活PAK,致Bad蛋白磷酸化[5]。③HIV-1 nef与P53蛋白结合,降低P53蛋白的半衰期、DNA结合能力及转录活性,从而阻止P53介导的凋亡[7]。④上调抗凋亡基因BCL-XL的表达而抑制凋亡[8]。HIV-1 nef的抗凋亡效应体现在它能够对抗HIV-1诱导的凋亡,保护HIV-1感染的宿主细胞[3,6]。而另一部分研究者则认为,HIV-1 nef诱导感染或转染含HIV-1 nef基因的细胞的凋亡。Rasola等[10]的实验表明,HIV-1 nef通过多种机制而增强细胞凋亡,包括降低抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达,激活半胱天氡蛋白酶及非半胱天氡蛋白酶通路而诱导凋亡。Lee[9]则认为HIV-1 nef通过作用于C-Jun N未端 (JNK)上游的信号蛋白Vav、Cdc42及Rac1等而激活JNK,促进细胞的凋亡。分析文献[3,5-10]发现HIV-1 nef在多种细胞或细胞系中均能促进或诱导细胞的凋亡,提示HIV-1 nef调节凋亡和细胞类型无关。

    HIV-1 感染的细胞寿命较短,但其存活时间较未感染的旁观者细胞长,提示HIV-1感染的细胞在一定程度上发生了凋亡,这可能与HIV-1 nef调节凋亡有关[2]。我们认为,HIV-1 nef调节凋亡具有两面性:细胞在某一特定状态下,HIV-1 nef促进其凋亡;而在另一特定状态下,HIV-1 nef则抑制其凋亡。至于在何种情况下HIV-1 nef促进或抑制感染或转染含该病毒蛋白基因的细胞的凋亡,有待于进一步的研究。

    3.3   HIV-1 nef 调节凋亡与下调MHC I类分子的关系 

    从本实验可以看出,转染了HIV-1 nef 的293T细胞,其表面的HLA-A,B,C分子下调。下调了HLA-A,B,C分子的293T细胞理应具有抗凋亡特性,而实验结果却显示该转染细胞有明显的凋亡。分析可能的原因:①细胞表面的MHC I类分子下调后的抗凋亡效应需要在有CTL存在的情况下才能体现出来。而对HIV-1感染的患者,体内有一定数量的CTL,推测HIV-1 nef 下调其感染细胞表面的MHC I类分子所致的抗调亡效应仍然存在。这可能系HIV-1 nef 保护HIV-1感染的细胞免受凋亡的一个重要原因。②HIV-1 nef调节凋亡具有两面性,转染了HIV-1 nef的293T细胞在这一特定的状态下发生了凋亡。

    综上所述,我们认为,HIV-1 nef下调细胞表面的MHC I类分子是持续存在的,而其诱导细胞凋亡是暂时的,有条件的。由于MHC I类分子的下调,HIV-1感染的细胞可能持久地免受宿主CTL的攻击。在HIV-1感染早期,HIV-1 nef保护感染细胞免受调亡,大量感染细胞存活,导致病毒大量复制。致感染晚期,感染细胞不能再提供病毒复制所需的材料,HIV-1 nef遂诱导感染细胞的凋亡。因此,若在感染早期,设法让HIV-1的病毒蛋白,包括HIV-1 nef,过早诱导感染细胞凋亡致病毒不能大量复制,可能有助于HIV-1患者的治疗

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