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日志

 
 

链置换扩增术(SDA)及其进展  

2015-05-15 23:09:46|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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关键词: 链置换扩增术;DNA检测  

  摘要 链置换扩增术(strand displacement amplification,SDA)是近几年发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制性核酸内切酶识别序列,核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口,DNA聚合酶继之延伸缺口3’端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行,使靶序列被高效扩增。本文主要介绍SDA的原理及其发展。 
  关键词 链置换扩增术;DNA检测 
  近几年来,随着分子生物学技术的迅速发展,基于核酸(DNA或RNA)检测的诊断方法(如各种PCR、Southern杂交和Northern 杂交)已大量建立并获得广泛应用。这给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。虽然这些方法在临床实践中也遇到一些问题,如PCR的假阳性与假阴性问题,但基因诊断具有一些特殊优点,如:需样量少、快速灵敏和准确、应用范围广泛;因此,众多学者学者不断改进现有技术探索新方法。新技术如转录依赖的扩增系统(TAS)、自主序列复制(3SR)、循环探针反应、Qβ复制酶扩增法、快速导流杂交法、DNA凝集反应等陆续出现。SDA就是在这样的背景下产生发展起来的,与其它的DNA扩增技术相比,SDA有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。 
  1992年,美国Becton Dickinson研究中心的Walker等发表了关于SDA的研究报道,标志一种新的DNA扩增技术SDA的诞生[1]。人们也在不断对SDA进行改良。用BsoBⅠ代替HincⅡ和采用exo-Bca酶代替exo-Klenow酶建立了嗜热SDA(thermophilic sDA),并以荧光偏振(Fluorescence Polarization,FP)检测技术代替电泳法作为SDA产物检测方法,使SDA检测更快速、灵敏且可定量。 
  2 SDA的原理 
  SDA是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术[1]。其基本系统包括一种限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引物、dNTP以及钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。 
  SDA中所用核酸内切酶的切割位点需专一,对识别位点的化学修饰敏感且在打开缺口后能立即解离让位于DNA聚合酶,如HincⅡ、HindⅡ;所用DNA聚合酶有链置换生活,但没有核酸外切酶活性(如cxo-Klenow)。因为3’→5’外切酶活性会使引物单链在反应中降解;5’→3’外切酶活性会使引物-靶序列杂交体中的5’悬端水解。DNA聚合酶需满足如下条件才能用于SDA反应:①无外切核酸酶活性;②于缺口处启动反应;③可利用dNTPas;④具有链置换活性。以上两种酶最好是耐热毒,如BsobⅠ和exo-Bca酶,以便提高SDA反应的温度以缩短反应时间、提高反应效率和提高SDA的特异性。应用BsoBⅠ和exo-Bca酶的SDA称嗜热SDA,能于20分钟内将靶DNA扩增1010倍,所用dNTP中有一种是经化学修饰的核苷酸(如dCTPas)一根据所用核酸内切酶的不同而不同。采用修饰核苷酸的目的是在SDA中形成修饰的核酸内切酶识别位点,使核酸内切酶不能切断双链DNA而只将其打开缺口。所用两对引物(B1,B2与S1,S2)中有一对(B1,B2)只含与靶片段互补的序列,而另一对(S1,S2)除含与靶片段互补的序列外,还在其5’端含所用核酸内切酶的识别序列(如BsoBⅠ的识别序列为5’-TCGGG),且S1(S2)在模板上的结合位点位于模板上B1(B2)结合位点的5’侧。 
  2.1制备单链DNA模板 用热解链法制备单链DNA模板可避免影响SDA体系的pH。其它制备方法如酶解链法未见报道。该阶段实际上只是在为SDA准备模板。 
  2.2两端带酶切位点的目的DNA片段的生成该阶段通过3次引物延伸和2次置换反应,以单链DNA为模板制备两端酶切位点的双链DNA片段。B1(B2)与S1(S2)分别结合在模板上相应结合位点并在DNA聚合酶作用下延伸其3’端;在B1(B2)延伸的同时,将由S1(S2)延伸所形成的链置换下来;置换下来的链(T1)的5’端含S1(S2)序列,继续参与反应:而B1(B2)与原始模板形成的双链则不再参与反应。T1含B2(B1)和S2(S1)的互补序列,与B2(B1)、S2(S1)结合并经特定DNA聚合酶的延伸和替换,获得一条5’端S2(S1)序列且3’端含S1(S2)互补序列的单链DNA(T2)。B2(B1)与T1形成的双链亦不再参与反应。T2再与S1(S2)结合并被DNA聚合酶延伸,从而形成两端均带有特定限制性核酸内切酶识别序列的双链DNA。该阶段无放大作用,是等摩尔反应。 
  2.3SDA循环 在此阶段,靶序列才被迅速放大。限制性核酸内切酶在其识别位点S1(S2)处将双链DNA打开缺口,DNA聚合酶延伸该切口的3’残端并替换下一条5’端含部分S1(S2)序列、3’端含S2(S1)互补序列的单链DNA(T3)。T3与S2(S1)结合并引导延伸而形成一条一端含S2(S1)序列、另一端含部分S1(S2)序列的双链DNA。核酸内切酶又可在其识别位点S2(S1)处将双链DNA打开缺口并通过DNA聚合酶的延伸和替换而获得一条5’端含部分S2(S1)序列3’端含部分S1(S2)互补序列的单链DNA(T4)。T4部分S1(S2)互补序列,可与S1(S2)结合,DNA聚合酶延伸T4-S1(S2)复合物的两个3’残端而形成一条一端含S1(S2)序列,另一端含部分S2(S1)序列的双链DNA。限制性核酸内切酶的切割、DNA聚合酶的延伸和替换、引物的延伸。如经反复进行,使SDA构成循环反应。 
  在DNA聚合酶延伸、替换生成单链的同时亦生成一条双链的DNA。该双链DNA可再被切割、延伸替换,并又有同一双链生成,从而构成SDA的双链循环。由于在SDA中单、双链都不断循环,故靶片段得以高效扩增。 
  3 DNA的研究进展 
  Walker等将由HincⅡ、exo-Klenow酶所组成的SDA系统用于扩增结核分枝杆菌IS6110 dNA片段,在37℃孵育2h,获得108倍扩增。1994年,Walker等在原单靶SDA(只对一靶片段进行扩增的SDA)的基础上将SDA的扩增序列拓展为两个,即建立了复合SDA(Multiplex sDA)[2]。Walker等使用由HincⅡ和exo-Klenow酶所组成的复合SDA系统(40℃孵育2h)成功地使结核菌IS6110和分枝菌16S dNA片段都获得108倍扩增[2]。之后,Walter,Zwadyk,Little等对SDA的引物特异性等与PCR作了比较[3-7]。但并没使SDA技术本身有多在发展。1996年SDA发展最迅速的一年,无论是SDA系统还是SDA产物检测方法都有较大革新。 
  3.1SDA产物检测方法的进展 Walker等将荧光技术引入SDA产生检测,建立了SDA的荧光偏振(Fluorescence polarization,FP)检测手段[4];该技术解决了用电泳检测SDA产物的拖尾问题,比电泳法更灵敏、快速且能定量。在SDA和FP检测技术中,一种5’端标记有荧光素的寡核苷酸探针被加入到SDA产物中,该荧光探针本身只有很弱的荧光效应,而一旦与相应互补序列形成双链,荧光效应就会大大增强。因此,通过检测荧光强度的增加就可得出SDA产物中靶DNA的含量。当加入一种DNA结合蛋白(如只有结合活性而无切割活性的EcoRⅠ),可使该法获得更满意的效果[8,9]。1997年Spears等将荧光探针加入到SDA循环中,建立了同步SDA荧光偏振检测技术(simutaneous sDA and FP detection)[10],用于检测沙眼衣原体获得成功。之后,FP就成为SDA产物检测的主导方法。也可通过DNA聚合酶延伸同位素标记的探针来检测。 
  3.2SDA系统的改进 Spargo等于1996年报道用BsobⅠ代替HincⅡ,用缺乏5’→3’核酸外切酶活性的exo-Bca酶代替exo-Klenow酶组成嗜热SDA(therm ophilic SDA)系统[11],将反应温度提高到60℃而时间则缩短到15min,且扩增效率提高100倍,而且使SDA产物更加专一,非特异扩增降低[11]。将嗜热SDA与FP结合的DNA检测技术能在30min内检测出极低含量的靶DNA,使SDA成为极具应用前景的核酸检测技术。 
  在SDA的临床应用方面,Down等和Ichiyama等人进行了一些有益的探索。Down等采用化学发光的方法对294例临床收集的痰标本进行了TBIS6110的检验,并根据校正曲线换算成相应的结核杆菌数目[12]。他们得出的初步结论是SDA可用于临床标本的结核杆菌检测。Ichiyama等人做了SDA与PCR和培养法检测结核杆功物临床对比实验[13]在用SDA、PCR和培养法对299位病人的530例痰标本进行结核杆菌检验的实验中,以细菌培养法作参考,SDA灵敏度为94.7%,PCR的灵敏度为89.5%,PCR的特异性为100%。Ichiyama等据此认为,在临床上检测痰标本中的结核杆菌方面,SDA应当是一种很有用的方法。 
  4 SDA的不足 
  一是SDA产物不均一。由于在SDA循环中总要产生一些不同的单、双链产物,这使得用电泳法检测SDA扩增产物时必然要出现拖尾现象。尽管有不少学者试图通过调节钙、镁离子浓度以及酶的用量来改善[7],但由于这是SDA的必然产物,目前的技术不可能根本消除。二是SDA产物的两端必然带有所用核酸内切酶的识别序列或其残端,因而SDA产物不可能直接用于克隆。这使得SDA在基因工程方面没有优势。三是目前SDA产物的检测手段尚不够如意。目前SDA产物检测的主导方法是荧光偏振检测法。但该检测方法需要特殊仪器——荧光分光光度计,这限制了SDA在临床的广泛应用。另外,SDA可能因标本中含有不明抑制物,使检测不能反映标本中靶DNA的真实含量。复合DNA中高含量靶DNA对低含量靶DNA的竟争抑制现象也很常见。 
  5 SDA的应用前景 
  如前所述,对SDA检测技术的研究已有取得可喜的成绩。嗜热SDA的建立并与FP结合,使高灵敏度、快速特异的SDA检测成为现实。最近,Mehrpouyan等人用SDA检测HIV-1 rNA获得成功[14],这说明SDA可用于所有核酸的检测。总之,虽然SDA尚有不如人意的地方,但随着其不断迅速发展,可以相信,SDA将成为临床疾病的诊治和科学研究的有用手段。

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