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lican8341的博客

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建立cDNA文库时cDNA的合成条件  

2015-05-05 21:10:58|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  cDNA合成 
  关键词: cDNA合成;逆转录酶;温度;时间  
   0 引言 
  建立cDNA文库并从中筛选出目的基因是一种十分有效的寻找未知基因的手段.cDNA文库的构建过程可粗分为总RNA的提取,mRNA的纯化,cDNA的合成以及将cDNA克隆入载体等几个主要步骤,其中cDNA的合成是其中最复杂也是文库建立成败的关键步骤.我们在建立肝癌细胞cDNA文库时经历了多次cDNA的合成过程,对其中的某些条件作了比较研究,得到了一些有益的经验. 
      
  1 材料和方法 
      
  1.1 材料  合成cDNA所用mRNA是从肝癌细胞系HHCC提取;禽源反转录酶AMV系Promega公司产品;基因工程反转录酶ExpandTM Reverse Transcriptase系宝灵曼公司产品;[α32 P]-dCTP系北京亚辉生物医学工程公司产品;紫外分光光度计Spectrometer lambda14系Perkin Elmer公司产品;放射性计数仪Radiation Monitor系美国SE公司产品. 
      
  1.2 合成cDNA时反转录酶的选择  mRNA经过紫外分光光度计验证其纯度并准确定量后分成2份,1份以AMV为反转录酶,另1份以ExpandTM Reverse Transcriptase为反转录酶,2份反应均以Oligo(dT)15 为引物,在反应体系中加入[α32 P]-dCTP.反应结束后进行14g?L-1 的碱性琼脂糖凝胶电泳,压上X光片.24h后显影以观察合成效果,具体操作参照文献[1].相同实验至少重复3次. 
      
  1.3 cDNA合成过程中反应温度和时间的控制  在确定了反转录酶的种类之后,将cDNA合成反应分成2组,进行两种不同温度和时间过程的控制.第1组按传统方法,即以42℃,60min合成cDNA第一链,然后16℃,4h合成cDNA第二链;第2组以42℃,45min然后升温至48℃,15min合成cD-NA第一链,以12℃,60min,22℃,60min合成cDNA第二链,两组同样以[α32 P]-dCTP掺入法验证cDNA合成效果.同位素掺入情况以cDNA电泳后放射性计数仪测得的每分钟计数为准. 
2 结果和讨论 
      
  2.1 构建cDNA文库对反转录酶的质量要求高  经过多次重复实验,证实以AMV为反转录酶合成的cDNA第一链比较正常,片段分布区域较宽,而第二链合成却有比较突出的缺陷,片段分布范围较窄(小于4.0kb),片段集中区分子量偏小(小于1.0kb),有明显的降解现象.这种结果可能与AMV本身含有较强的RNaseH活性及在酶的生产过程中难以避免污染有核酶内切酶有关[2] .以ExpandTM Reverse Transcrip-tase为反转录酶合成的cDNA两链均正常,特别是cDNA第二链分布较广(从0.3~9.0kb),且片段集中区在2.0kb上下,完全符合哺乳动物细胞mRNA的分布规律.此酶为基因工程产品,它的RNaseH活性已被突变掉,且它的生产过程也可避免外源性污染.构建文库的逆转录反应有它不同于其他逆转录反应(如RT-PCR)的特点:cDNA合成反应进行的时间长,合成的cDNA片段长度不均一且片段大小分布范围广.所以它对反转录酶的要求也较高,我们在构建文库时应充分考虑这一点. 
      
  2.2 cDNA合成反应时间可以缩短  放射性计数值与cD-NA的合成量是呈正相关的,我们对3次实验中2组不同温度、时间控制下合成的cDNA进行了计数.结果组1的3次反应计数值分别为16850,16778和16760r?min-1 (平均值为16796r?min-1 ).组2的3次反应计数值分别为16876,16802和17118r?min-1 (平均值为16932r?min 
-1 ).2组计数值虽略有差别,但无统计学意义,说明在2组反应条件下cDNA的合成效果相当.第2组反应条件是我们针对酶的特性制定的[3] ,当反转录酶作用42℃,45min时,大部分mRNA模板会被反转录成cDNA第一链,但可能也有少数二级结构较复杂的mRNA不能被反转录.当我们升温至48℃再反应15min,可以将这部分有复杂二级结构的mRNA反转录成cDNA.cDNA第二链合成时,先在12℃低温反应,以保证RNaseH在低活性状态下即能在mRNA/cDNA杂合链上使mRNA产生缺口,又不至于产生大的缺失,再将反应陡升至22℃以便最大限度地发挥DNA聚合酶活性,快速将mRNA置换成cDNA第二链,这样就大大缩短了反应时间(较传统方法缩短2h),提高了工作效率.  
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