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日志

 
 

CdS量子点制备与单增李斯特菌抗体偶联的研究  

2015-06-20 22:49:25|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  以CdCl2和Na2S为原料,以巯基乙酸为稳定剂,采取水相合成方法制备了CdS量子点。结果表明,合成CdS量子点最佳条件是:作用时间3 h,[Cd2+]∶[S2-]为2∶1, 50 μL稳定剂,pH 8.0,反应温度30 ℃。通过EDC·HCl和NHS的作用,成功地将单增李斯特菌抗体IgG与CdS量子点偶联。偶联后的IgGCdS荧光强度显著增强,为偶联前的4倍。血清凝集反应和直接免疫荧光实验证明,偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体的特性没有发生变化,在荧光显微镜下可快速灵敏地检测出单增李斯特菌。本方法特异性强、稳定性和重复性高,可用于食品中致病菌的快速检测。

【关键词】  量子点;单增李斯特菌;偶联;荧光强度

 1 引 言

  CdS为ⅡⅥ型量子点,是常见核壳型量子点的主要组成部分[1]。CdS量子点具有良好的光学性质,合成发射不同颜色荧光的水溶性CdS量子点对于多色生物标记和核壳型量子点合成具有重要意义。有关CdS量子点的制备的研究较多[2~5],且多采用化学液相法。该方法具有反应条件温和、易控制,可制得组成均匀、纯度高的纳米材料等优点。

  单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,简称单增李斯特菌)是一种能使人和动物患脑膜炎、败血症以及流产等疾病的致病菌,死亡率极高。检测单增李斯特菌的常规方法虽然准确性好,但所需时间长,操作繁琐,不能满足当前食品安全快速检测的要求。分子生物学方法快速、灵敏、特异性强,但成本较高,且要求较高的技术水准;大型仪器分析方法[6] 如VITEK(全自动细菌鉴定/药敏系统)、MIS(微生物鉴定系统)等,虽然快速准确、检测量大,但仪器费用颇高,一般检测单位和食品企业不具备这种条件;免疫学中ELISA方法,操作简便、快速、灵敏,因而广泛应用于致病菌的检测。

  本研究利用纳米材料的光学性质和免疫学反应的特异灵敏性,进行了CdS量子点与单增李斯特菌抗体偶联的研究,对单增李斯特菌进行了快速检测。本方法适用于食品安全的致病菌快速检测。

  2 实验部分

  2.1 仪器与试剂

  DF101S智能集热式恒温加热磁力搅拌器(上海东玺制冷仪器设备有限公司); UV1700紫外分光光度计、RF5301荧光分光光度计(日本Shimadzu公司); JEM2010透射电子显微镜(日本JEOL LTD公司)、Nikon 80i荧光显微镜(日本Nikon公司)。

  单增李斯特菌抗体(本实验室制备); 巯基乙酸(TGA)、硫代乙酰胺(TAA)、CdCl2·2.5H2O、Na2S·9H2O和KOH(分析纯,国药集团); N羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1乙基(3二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl, 分析纯,上海晶纯试剂有限公司)。水为去离子水。

  2.2 CdS量子点的合成及条件优化

  参照并改进文献[7]的方法,合成CdS量子点。在一定温度下,在100 mL三口烧瓶中加入50 mL 去离子水和1 mL 0.0585 mol/L CdCl2溶液,充氮气除氧20 min后加入TGA,调节pH值,继续充氮气除氧10 min后加入1mL 0.0585 mol/L Na2S溶液,继续通氮气除氧密闭搅拌后即得水溶性CdS量子点溶胶。稀释后测其紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱。按表1所列条件合成CdS量子点。表1 CdS量子点合成的反应条件

  2.3 CdS量子点的表征分析

  (1)透射电子显微镜(TEM)表征分析:取少量CdS溶液,用于TEM观察; (2)紫外吸收分析:取少量CdS溶液进行紫外扫描分析,扫描波长范围为200~600 nm; (3)荧光光谱分析: 将CdS量子点溶液进行荧光光谱扫描。扫描范围220.0~800.0 nm,激发波长: 350.0 nm,激发狭缝: 5.0 nm, 发射狭缝: 5.0 nm。

  2.4 CdS量子点与单增李斯特菌抗体IgG偶联

  参照并改进文献[8]的方法。取水溶性量子点/磷酸盐缓冲液30 μL,加入20 μL 60 g/L EDC·HCl溶液,振荡混匀,再加入100 μL 0.15 g/L NHS 溶液,20 ℃温和搅拌0.5 h,在持续搅拌下与含0.14 mg单增李斯特菌抗体IgG 的磷酸盐缓冲溶液混合、密闭,20 ℃继续搅拌0.5 h。

  2.5 偶联CdS量子点单增李斯特菌抗体的特性测定

  (1)血清凝集实验:在洁净载玻片上滴加一滴偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体溶液后,加适量的单增李斯特菌菌体抗原,轻轻晃动载玻片使二者混匀,观察载玻片上是否有凝集的细小颗粒。待载玻片上的反应物自然干燥后用荧光显微镜观察。(2)直接荧光免疫实验:在洁净载玻片上滴加适量的单增李斯特菌灭活抗原,自然干燥,在-20 ℃用丙酮固定10~15 min,加偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体溶液,37 ℃温育1 h,取出玻片用蒸馏水洗涤,再经0.1%伊文氏兰染色、洗涤,完全干燥后在荧光显微镜下进行检测。

  3 结果与讨论

  3.1 CdS量子点的表征分析

  本实验制备的CdS量子点在TEM下观察(图1)以单分散形式存在,分散性良好,颗粒均匀呈球形,直径约5 nm;UVvis分析(图2)表明,在400 nm处有较强的吸收峰。

  图1 CdS量子点的透射电子显微镜照片

  Fig.1 TEM photograph of CdS QDs 图2 CdS量子点的紫外吸收光谱

  Fig.2 UVvis absorption spectrum of CdS QDs3.2 反应时间对量子点粒径和荧光光谱的影响

  随着制备量子点反应时间延长,CdS量子点的紫外吸收产生逐渐红移现象。量子点的制备反应时间对量子点的荧光强度有一定影响。当反应时间为3 h时,合成CdS量子点的荧光强度最强;反应时间为1 h时,CdS量子点的荧光强度最弱;当反应时间为2, 4和5 h时,合成CdS量子点的荧光强度比较接近,处于中等水平。

  3.3 [Cd2+]与[S2-]比例对制备CdS量子点的影响

  合成CdS量子点的[Cd2+]与[S2-]的比例不同, 其紫外吸收曲线也有差异。当[Cd2+]∶[S2-]=1∶1和2∶1时,在400 nm处有较强的紫外吸收峰;当[Cd2+]∶[S2-]=1∶2时,在430 nm处有较强的紫外吸收,量子点的紫外吸收曲线很明显地发生了红移。

  由表2可知,当[Cd2+]∶[S2-]的比例不同时,制备的CdS量子点荧光强度也有很大差别。当[Cd2+]∶[S2-] =2∶1时, CdS量子点荧光强度最大,约为[Cd2+]∶[S2-]=1∶2的13倍,[Cd2+]∶[S2-]=1∶1的5倍; 当[Cd2+]∶[S2-]=1∶2时,CdS量子点的荧光吸收峰发生明显红移效应。Cd2+过量更易得到粒径小、荧光强度高的CdS量子点。这是由于Cd2+、S2-等在粒子表面发生了复杂的吸附作用。根据Fajans规则[9],构晶离子将优先吸附在粒子表面。CdS 量子点表面通过静电吸附这种配合物起到稳定作用。而S2-过量时,不能形成这样的包覆层。 表2 [Cd2+]∶[S2-]不同比例制备的CdS量子点荧光强度

3.4 稳定剂对CdS量子点的影响

  胶体法制备量子点常用的稳定剂有六偏磷酸钠(HMP)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)[10,11]及TGA等巯基类化合物[12]。本实验以TGA为稳定剂。随着稳定剂含量的增加,CdS量子点紫外吸收曲线发生红移。由表3可知,添加不同体积TGA,合成的CdS量子点在550 ~600 nm之间有荧光吸收,但荧光强度有很大的影响。加入50 μL TGA制备的CdS量子点荧光强度最强,约是加入100和150 μL TGA的6倍和18倍。表3 不同体积巯基乙酸制备的CdS量子点荧光强度

  由表4可知,当体系中的pH值升高时,量子点的荧光吸收略微出现红移,而荧光强度则急剧降低。结果表明,在pH 8时,CdS量子点的荧光强度最强,约是pH 9和pH 10时的14倍和22倍。随着pH值降低,CdS 量子点的荧光逐渐增强。这是由于在较低的pH下,粒子表面高度质子化的硫化钠分子减少了粒子间的氢键作用且使粒子ξ电位增加[13],从而提高了粒子的分散性。表4 不同pH 条件下制备的CdS量子点荧光强度

  3.5 温度对合成CdS量子点的影响

  在40 ℃下,制备的CdS量子点在400 nm处有较强的紫外吸收,在30 ℃和50 ℃条件下制备的CdS量子点紫外吸收发生红移。当制备量子点的温度升高时,量子点的荧光吸收峰逐渐红移。如表5所示,反应温度越低,生成量子点的颗粒越小,对应的荧光发射峰波长越小;反之,温度越高,生成量子点的颗粒越大,对应的荧光发射峰波长越大。当反应温度为30 ℃时,其荧光吸收峰在560 nm处;反应温度为40 ℃时,其荧光吸收峰在590 nm处;如果将反应温度升到50℃,其荧光吸收峰转移到700 nm附近。量子点的荧光强度随着温度的升高有所降低,30 ℃时合成的量子点荧光强度最强,40 ℃和50 ℃时合成的量子点荧光强度较为接近,但均比30 ℃时弱。表5 不同温度条件下制备的CdS量子点荧光强度

  3.6 CdSIgG的表征分析

  由图3可见,偶联单增李斯特菌抗体IgG的CdS量子点仍以单分散形式存在,形态均匀、呈球形,粒径大小约为8 nm,较CdS量子点稍大。

  单增李斯特菌抗体IgG的紫外吸收光谱(图4)显示,在280 nm处出现的强吸收峰,为蛋白质的特征吸收峰。CdSIgG偶联后只在410 nm处有较强的紫外吸收峰,而蛋白质特征吸收峰则消失。

  Fig.4 UVvis absorption spectrum of antibody IgG如图5所示,在682~715 nm处CdS量子点和抗体IgG蛋白以及偶联后的CdSIgG均有荧光吸收峰,其中CdS量子点的荧光强度比IgG蛋白略高。但经过偶联后,CdSIgG的荧光强度明显增强,约是单独存在时的4倍。IgG偶联的CdS量子点荧光光谱与偶联前水溶性量子点相比,发射波长(λem)几乎没有变化,说明CdSIgG保持了原有水溶性量子点的荧光发射特性。

  图5 CdS量子点、IgG抗体和CdSIgG荧光光谱

  3.7 偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体特性的测定

  3.7.1 血清凝集实验 对偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体进行血清凝集实验发现,在抗体与抗原接触混匀后约30 s,肉眼可清晰看见有固体小颗粒形成,说明抗原与抗体发生了凝集反应,偶联量子点后的抗体性质没有发生变化。在对反应样品进行荧光显微镜镜检时,可清楚地看到凝集成团的菌体表面有荧光出现(图6)。

  3.7.2 直接荧光免疫实验 用直接免疫荧光实验对单增李斯特菌进行检测结果显示,加入有荧光CdS量子点标记的单增李斯特菌抗体反应后,载玻片上的菌体有特异性黄绿色荧光出现(图7)。

  图6 血清凝集实验显微镜照片(a)和荧光显微镜照片(b)

  Fig.6 Microscope photograph(a) and fluorescence microscope photograph(b) of SAT图7 直接免疫荧光实验显微镜照片(a)和荧光显微镜照片(b)

  Fig.7 Microscope photograph(a) and fluorescence microscope photograph(b) of direct immunofluorescence4 结 论

  通过EDC·HCl与NHS的作用,使单增李斯特菌抗体IgG与CdS量子点偶联稳定,体系的荧光峰位置没有发生变化,但荧光强度显著增强,偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体的荧光强度是偶联前的4倍。结果证明: 巯基能与硫化镉产生较强的相互作用。当修饰剂与硫化镉作用加强时,会导致硫化镉纳米微粒的荧光强度增强,这与文献[14]报道的结果一致。通过血清凝集反应和直接免疫荧光实验证明,偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体的特性没有发生变化,在荧光显微镜下可快速灵敏地检测出单增李斯特菌。由于偶联CdS量子点的单增李斯特菌抗体荧光强度显著增强,只要样品中有极少量的单增李斯特菌在荧光显微镜下就会被抗体捕获到并发出荧光。

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