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lican8341的博客

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新型固定化铁离子亲和色谱整体柱的制备及评价  

2015-06-20 23:17:37|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  以N丙烯酰氧基琥珀酰亚胺为功能单体,制备了含有高活性基团的整体材料基质。以次氨基三乙酸为配体,通过固载Fe3+,发展了一种固定化Fe3+亲和色谱(FeIMAC)整体柱的制备方法。该整体柱不仅对磷酸化肽具有很好的选择性,而且富集容量大、回收率高、重现性好。此外,利用该整体柱实现了牛奶蛋白质酶解产物中磷酸化肽段的选择性富集。本实验研制的FeIMAC整体柱有望用于磷酸化蛋白质组研究。

【关键词】  固定化金属离子亲和色谱; 磷酸化肽; 选择性富集; 整体柱; 铁

 1 引 言

  蛋白质磷酸化修饰在信号传导、代谢调节、细胞功能调控等生命活动中发挥着重要作用[1,2]。然而磷酸化蛋白/肽通常含量较低,且在质谱分析中易受到大量非磷酸化蛋白/肽的干扰,因此发展针对磷酸化肽选择性富集的新材料对于深入开展磷酸化蛋白质组研究至关重要[3]。

  固定化金属亲和色谱(IMAC)是目前最常用的磷酸化富集技术之一。通常利用Fe3+, Ti4+, Zr4+, Ga3+等金属离子与次氨基三乙酸(NTA)的螯合作用来实现金属离子在硅胶、树脂或琼脂糖等基质材料上的固载,并通过金属离子与磷酸化肽中PO3-4的螯合作用,实现磷酸化肽的选择性富集[4~10]。在上述基质材料中,硅胶具有较好的机械性能,但耐酸碱性差;树脂和琼脂糖适用的pH范围较宽,但机械强度差。此外,颗粒基质相对整体材料基质而言,传质速度慢,背压较大[11~13]。因此,发展基于耐酸碱性和生物兼容性好的新型IMAC聚合物整体材料对于提高磷酸化肽的选择性富集能力具有重要意义。

  本研究以具有高活性的琥珀酰亚胺官能团的聚合物整体材料为基质,以NTA为配体,通过固载Fe3+,发展了一种新型IMAC整体材料的制备方法。本方法不仅操作简单, 时间短, 制备材料的重现性高,而且通过对磷酸化和非磷酸化混合物,以及牛奶蛋白酶解产物的分析,显示出较高的磷酸化肽选择性富集能力。

  2 实验部分

  2.1 仪器与试剂

  JSM6360LV扫描电镜(SEM,日本Jeol公司);Ultraflex III MALDITOF/TOF MS(德国Bruker 公司)。N,N二羧基甲基L赖氨酸(ABNTA)、N,N二甲基甲酰胺(DMF)、3(三甲氧基硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯(γMAPS)、2,5二羟基苯甲酸(DHB)(美国Sigma公司);N丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)、乙叉二甲基丙烯酸酯(EDMA)、癸醇(1Decanol)购于德国Fluka化学公司; 乙腈(色谱纯,Merck公司);偶氮二异丁腈(AIBN)、甲酸(FA)、三氯化铁等均为国产分析纯试剂;磷酸化肽GTpYGV、GTYGVYKVPQLEIVPNpSAEER和非磷酸化肽GTYGV(纯度≥95%,上海吉尔生化有限公司);熔融石英毛细管(530 μm I.D., 690 μm O.D.,邯郸鑫诺光纤色谱有限公司);实验用水均经过MiliQ水处理系统(美国Millipore公司)处理。

  2.2 实验方法

  2.2.1 FeIMAC整体柱的制备 将环己醇、癸醇和DMF按质量比76.5∶8.5∶15配制三元致孔剂。将NAS、EDMA和三元致孔剂按16∶24∶60的质量比配制聚合物溶液,并加入质量比为1%的引发剂AIBN。室温下将溶液混匀后,通N2 5 min,除去溶解的O2。随后将溶液注入经γMAPS处理的熔融石英毛细管[14]中。用硅橡胶封闭毛细管两端后,在55 ℃水浴中反应16 h,制备整体材料基质。用DMF冲洗除去致孔剂和未反应单体后,将0.1 mol/L ABNTA溶液(pH 10)注入毛细管中,并在室温下反应1 h。最后,依次用0.1%(V/V) FA和100 mmol/L FeCl3溶液冲洗基质材料,实现Fe3+的固定化。

  2.2.2 合成磷酸肽的富集 FeIMAC整体柱先用125 μL 0.1% FA以4 μL/min的流速浸润。再将溶于0.1% FA, 0.01 g/L GTpYGV和GTYGV的混合物以0.5 μL/min的流速上样100 min。然后,依次用125 μL 40% ACN(含0.1% FA)和0.1% FA水溶液淋洗;最后,用125 μL NH3·H2O(质量浓度为0.01%,pH 10.5)进行洗脱。淋洗和洗脱收集的组分分别经冷冻干燥后溶于20 μL 0.1% FA,并采用HPLC进行分析。上述百分比如无特殊说明,均为体积比。

  2.2.3 牛奶酶解产物中磷酸化肽的富集 脱脂牛奶经Bradford法测得蛋白质浓度为20 g/L。取牛奶10 μL,按文献[6]进行处理。将0.2 g/mL酶解产物,以2 μL/min的流速上样100 μL。其它淋洗和洗脱条件与合成磷酸肽的处理方法相同。富集的肽段冻干后重新溶解于20 μL DHB基质溶液[6]中,并用MALDITOF MS检测。

  2.2.4 HPLC条件 FeIMAC整体柱的选择性、回收率、重现性等性能评价实验的HPLC条件为:流动相A为0.1% TFA;流动相B为含0.1% TFA的ACN;梯度洗脱: 0~5 min,2% B;5~15 min,40% B。

  3 结果与讨论

  3.1 FeIMAC整体柱基质材料表征

  由于制备的基质材料以NAS为功能单体,其与配基NTA的反应活性远远高于传统带环氧基的功能单体。因此,可将基质材料的制备时间由传统的10 h缩短到1 h。由电镜表征结果(图1)可以看出,制备的聚(NASEDMA)基质材料不仅微观结构均一,而且存在大量亚微米级的孔,确保了材料的通透性。

  3.2 FeIMAC整体柱的选择性

  以GTpYGV与GTYGV的混合物为样品,考察了FeIMAC整体柱对磷酸化肽富集的选择性。从图2可以看出,FeIMAC整体柱对磷酸化肽具有高选择性。根据富集分离前后淋洗液和洗脱液中肽段峰面积的比值,计算出非磷酸肽和磷酸肽的回收率分别为93.9%±6.7%和83.1%±5.7 %(n=3)。说明本整体柱对样品具有较高的回收率。

  3.3 FeIMAC整体柱的重现性

  以GTpYGV与GTYGV的混合物为样品,考察了FeIMAC整体柱对磷酸肽富集的重现性。首先将样品直接冻干、重溶后进行HPLC分析。获得磷酸肽和非磷酸肽峰面积的日内RSD(系统日内重现性)分别为5.9%和5.5%(n=3)。由表1可以看出,混合物经FeIMAC整体柱选择性富集后,日内、日间、同一批次不同柱子间以及不同批次柱子间所得每个馏分的峰面积重现性与系统日内重现性相当。说明制备的FeIMAC整体柱性能稳定、重现性好。表1 铁离子亲和色谱整体柱的重现性

  Phosphopeptide6.86.78.66.4 图2 GTpYGV与GTYGV混合标准品直接上样(a)、FeIMAC整体柱洗脱馏分(b)和淋洗馏分(c)的HPLC谱图

 Fig.2 Chromatograms of a mixture of GTpYGV (1) and GTYGV (2) by direct injection (a), eluant of ammonia (b) and eluant of 0.1% FA (c) from monolithic Feimmobilized metal affinity chromatography(FeIMAC) column3.4 FeIMAC整体柱的柱容量

  采用前沿分析法[15]测定了FeIMAC整体柱的柱容量。以硫脲通过FeIMAC柱到达检测器的时间为死时间;以2 g/L磷酸化肽(YKVPQLEIVPNpSAEER)到达检测器的时间为样品保留时间;硫脲和磷酸化肽的流速均为1 μL/min。平行实验3次,获得FeIMAC整体柱对磷酸化肽的平均柱容量为3.2 g/L(RSD=10.7%)。

  3.5 牛奶蛋白酶解产物中磷酸化肽的选择性富集

  考察了FeIMAC整体柱对牛奶蛋白酶解产物中磷酸化肽的富集能力。由图3可以看出,直接分析时,由于存在大量非磷酸肽的干扰,只检测到4条磷酸肽,且信号较低;富集后,由于有效去除了非磷酸化肽,共鉴定出10条磷酸化肽,且磷酸化肽的检测灵敏度均有不同程度的提高, 说明研制的FeIMAC整体柱对实际样品中的磷酸肽具有很好的富集效果。此外,通过在相同的基质材料上固载钛或锆离子,有望进一步提高磷酸化肽的富集选择性。

  图3 牛奶酶解产物经FeIMAC整体柱富集前(a)后(b)的MALDITOF MS谱图(磷酸化肽段的质谱峰以*注明,去磷酸化肽段的质谱峰以#注明)

  Fig.3 MALDITOF mass spectra of protein digests from nonfat milk before (a) and after (b) enrichment by FeIMAC monolithic column (Phosphopeptide ions derived are marked with asterisks and the metastable losses of phosphoric acid are indicated with #)

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