注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

基于包被包膜糖蛋白抗体纳米金磁性微粒的无试剂安培免疫传感器  

2015-06-26 22:21:33|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

【摘要】  在玻碳电极(GCE)表面固定对H2O2有催化还原活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(GCE|CuL);再在GCE|CuL表面修饰一层金磁微粒壳聚糖复合膜(nano Au/Fe3O4/Chit), 进而固定艾滋病毒(HIV)诊断标志物——包膜糖蛋白(gp160)抗体(anti gp160), 由此构建了一类快速检测 gp160的无试剂安培免疫传感器。当该传感器在含gp160溶液中37 ℃下温育30 min后, 传感器表面生成的免疫复合物随gp160浓度的增大而增加, 导致CuL 对H2O2 电催化还原效果降低, 催化电流呈现下降趋势。在PBS溶液(pH 7.0)和-300 mV下, 催化电流的降低值ΔIo与gp160浓度在1~400 μg/L 呈线性关系; 检出限为0.5 μg/L(3σ)。研制的免疫传感器检测gp160时, 一步免疫反应即可得结果, 较相同条件下包被gp160抗体的纳米金单分子层修饰电极灵敏度更高, 检测范围更宽, 有望用于艾滋病人血清标志物gp160快速筛测。

【关键词】  富马酸二甲酯联吡啶铜, 纳米金, 磁性微粒, 壳聚糖, 艾滋病毒,包膜糖蛋白, 安培免疫传感器

  1 引 言

  人类免疫缺陷病毒(HIV)感染的早期检出对杜绝艾滋病传播极其重要, 常用的艾滋病诊断方式是抗体检测[1]。在艾滋病毒感染早期, 人体内尚未出现抗体(即 “窗口期”), 已具有很强的传染性[2]。此时,“窗口期”HIV的诊断标志物——包膜糖蛋白抗原(gp160)已经存在于人血清中, 但含量很低(<8 μg/L), 若能对其检测将有效缩短诊断“窗口期”[3]。目前, 主要采用化学发光酶联免疫(ELISA)法检测痕量gp160[3], 该法虽然结果准确, 但是操作繁琐、仪器昂贵, 限制了其推广。电化学免疫分析具有操作简便、样品量少、快速灵敏等特点, 已应用于临床检测[4~9]。由于缺乏简单而又能长期保持抗体生物活性的电极固定方法, 且通常需要在反应体系中加入电子媒介体(eT)以加速电子传递, 导致基底干扰并使抗体失活, 限制了其应用[5~9]。近年来, 通过在金胶等具有良好生物兼容性的纳米颗粒上包被抗体, 并将其与eT共固定到电极表面, 获得了灵敏度高、无需外加eT、且抗体不易失活的无试剂安培免疫传感器[10~14]。He等[9]通过在电极表面的壳聚糖(Chit)膜上层层电沉积纳米金, 包被癌胚抗原(CEA)抗体, 获得了测定CEA的安培免疫传感器。由于电极表面有多层纳米金, 比单分子层纳米金吸附更多抗体, 因此在检测CEA时线性范围更宽, 灵敏度更高。然而该电极检测需在电解池中加铁氰化钾作eT, 体系复杂,易导致抗体失活, 且电极表面需多步纳米修饰, 操作繁琐。本研究组在单分散Fe3O4微粒表面负载纳米金, 合成了nano Au/Fe3O4金磁性微粒[12]。在每个Fe3O4微粒表面包裹着多个纳米金, 再接枝到电极表面形成单分子层将比单层纳米金吸附更多抗体, 扩展传感器检测范围, 提高灵敏度。某些铜配合物具有催化H2O2活性, 可代替H2O2酶被修饰在电极表面制作H2O2传感器[15]。基于以上思路, 本实验合成了对H2O2具有催化活性的富马酸二甲酯联吡啶铜(CuL)[16], 将其与gp160抗体包被金磁微粒壳聚糖复合膜共固定在GCE上, 制备了gp160免疫传感电极, 并用于血清样本检验。

        2 实验部分

  2.1 仪器与试剂

  CHI660B电化学分析工作站(上海辰华公司);三电极体系:GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(φ=2 mm)为工作电极, 铂电极为对电极, 饱和甘汞电极为参比电极;Easysizer20激光粒度仪(美国欧美克公司);VF320型X射线荧光光谱仪(日本岛津公司);PHI5400X射线光电子能谱仪(美国PE公司), Hitachi X650扫描电镜(日本Hitachi公司)。

  直径50~400 nm的Fe3O4微粒(美国Fluka公司);3巯丙基三乙氧基硅烷(95%)、壳聚糖(Chit, 脱乙酰度>90.0%)及AuCl3·HCl·4H2O购自上海国药试剂公司。人抗人类免疫缺陷病毒抗体(HIV)ELISA试剂盒(美国ADL公司):包括不同浓度(0~500 μg/L)的gp160抗原和单克隆gp160抗体(Anti gp160);牛血清蛋白(BSA, 96%~99%)与人血清蛋白(HSA, 96%~99%)购自美国Sigma公司。其它试剂均为分析纯, 实验用水为超纯水(美国Millipore纯水器)。

  2.2 Nano Au/Fe3O4/Chit共聚物合成

  按文献[16]合成富马酸二甲酯联吡啶铜([Cu(bpy)2(H2O)]2(C6H8O4)2(ClO4)4)。Nano Au/Fe3O4溶胶参考文献[10~12]合成, 用粒度分析仪和TEM测得金磁微粒直径为(280±1.2) nm, 纳米金粒径为(30±1.7) nm, 浓度为5×107粒/mL。根据X射线能谱分析, 颗粒表面Au和Fe的质量分数分别为23.7%和40.2%, 估算出每个Fe3O4包被10~20个金胶。Nano Au/Fe3O4/Chit溶胶参考文献[10]方法制备:将1 mL Nano Au/Fe3O4溶胶与2 mL 0.1%壳聚糖0.05 mmol/L HAc混合,搅拌2 h, 在4 ℃下放置过夜。

  2.3 GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160 电极的制备和检测

  将玻碳电极浸于1.0 mmol/L CuL二甲苯溶液中,10 h后取出, 以二次蒸馏水反复冲洗去除电极表面杂质, 自然干燥, 制得 GCE|CuL 电极[15]。按照文献[9]方法, 取10 μL nano Au/Fe3O4/Chit溶液滴在GCE|CuL电极表面形成一层稳定膜, 室温晾干, 进而将其浸入anti gp160溶液中于25 ℃放置7 h, 即得GCE|CuL/nanoAu/Fe3O4/Chit/anti gp160免疫电极。再将此电极浸入5%BSA溶液中5 h, 封闭抗体未包被的电极表面, 制备过程见图1。实验中始终维持N2气氛。

  2.4 测定过程

  本免疫分析是基于免疫结合物的生成阻碍CuL与H2O2之间的电子传递而进行测定。参照文献[14]方法, 首先分别测定在5 mL 除氧的0.1 mol/L PBS 溶液(pH 7.0)和含1 mmol/L H2O2 的相同底液中, 免疫传感器在-300 mV 下电解120 s时的安培响应i0和iH。将免疫传感器在含待测gp160的溶液中于37 ℃下温育30 min, 在同样条件下测定含1 mmol/L H2O2的PBS 溶液(pH 7.0)中的安培响应i, 计算安培响应的降低百分率100×(iH-i)/(iH-i0)。

         3 结果与讨论

  3.1 HIV免疫传感器的表征

  采用交流阻抗谱对电极修饰过程进行了表征。如图2所示, 裸GCE上FeCN高频区的Ret较小。随着CuL, Chit, nano Au/Fe3O4/Chit膜不断修饰到GCE后(图2 b~d), 高频区半圆直径不断增大, 表明抗体修饰膜的形成阻碍了FeCN电化学反应。 图2 免疫传感器制备过程中不同电极的交流阻抗图

  Fig.2 AC impedance plot of(a) bare GCE(b) GCE|CuL(c) GCE|CuL/Chit(d) GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160(e) the electrode of(d) closed by BSA in 5 mmol/L Fe(CN)3-/4-6+0.5 mol/L KCl solution. The frequency range was 0.1-1.0×105 Hz

  采用SEM对包被抗体前后的电极表面进行了表征。图3a显示电极表面有许多白色亮点, 推测是nano Au/Fe3O4反射形成的[14];当 anti gp160 包被后, 电极表面形态发生了明显变化, 出现了很多岛型片状物质, 推测是抗体固定在电极表面的形貌(图3b)。

  图3 (a) GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit和已经包被anti gp160电极(b)的扫描电镜图

  Fig.3 Scan electron microscopic images of GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit(a) and GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160 electrode(b)采用X射线荧光光谱(测定元素范围为9F~92U)对免疫传感电极表面进行表征, 显示了Cuk(峰(2θ=123.7)和Sk(峰(2θ=110.5), 由于gp160抗体富含甲硫氨基酸[3], 说明CuL和anti gp160被修饰到电极表面。对吸附了CuL的石墨片进行了XPS分析, 932.7/954.3 eV处出现了Cu2+的特征峰Cu(2P3/2, 2P1/2), 表明铜离子为+2价。

  3.2 GCE|CuL和GCE|CuL/nano Au/Fe3O4修饰电极的伏安行为

  GCE|CuL修饰电极在PBS(pH 7.0)中的循环伏安曲线如图4A所示。由图4A(a)可知, 在扫描速度100 mV/s时, CuL有一对稳定的氧化还原峰, 峰电位分别为14和-310 mV。在底液中加入1 mmol/L H2O2后, 还原峰增大而氧化峰减小(图4A(b)), 说明GCE|CuL可催化H2O2的还原。在GCE|CuL上修饰Fe3O4微粒后, 电极在PBS中的氧化还原电流显著提高(图4A(c)), 而GCE|CuL修饰nano Au/Fe3O4后电流增强更明显(图4A(d))。

  文献[17, 18]报道纳米Fe3O4和纳米Au均有增强GCE表面电子传递功能, 并可提供抗体维持活性的微环境。本实验发现两者形成复合微粒后, 这种增强效应具有可叠加性。GCE|CuL在50~300 mV/s扫速范围内, 阳极和阴极峰电流均随扫速增大而增加, 并呈线性关系(图4B), 表现出明显的表面控制过程。由不同扫速下阴极与阳极峰的电位差可计算获得该过程的平均电子传递速率为(1.57±0.12) s-1。CuL表面覆盖度为(9.02±1.13)×10-10 mol/cm2, 这一数值相当于电极表面覆盖的为单分子层[13]。计算得反应电子数n=1.77≈2, 表明电极表面发生了Cu/Cu(0)的电子转移。

  图4 (A) GCE|CuL电极在0.02 mol/L PBS(pH 7.0)底液中(a)和加入1 mmol/L H2O2后(b);GCE|CuL/Fe3O4电极(c)和GCE|CuL/nano Au/Fe3O4 电极(d)在相同底液中的循环伏安图; (B) GCE|CuL电极在不同扫速下的的循环伏安图

  Fig.4 (A) Cyclic voltammogram of GCE|CuL CME not add(a) and added 1 mmol/L H2O2(b); GCE|CuL/Fe3O4(c) and GCE|CuL/nano Au/Fe3O4 CME(d) in 0.02 mol/L PBS(pH 7.0) at scan rate of 100 mV/s. (B) Cyclic voltammogram of GCE|CuL CME at different scan rate, a~f: 50, 100, 150, 200, 250 and 300 mV/s, respectively. 插图(Insert): ip~v3.3 免疫传感器的电化学行为及对gp160检测

  图5a为裸电极在底液中循环伏安(CV)图, 没有任何电流响应。图5b为该免疫传感器在底液中CV图, 和相同扫速下的GCE|CuL相比(图4a), 氧化峰电位正移而还原峰电位负移。由实验可知nano Au/Fe3O4, Chit, anti gp160均无电活性, 故氧化还原峰对应于CuL的氧化还原反应可逆性下降, 可归因为Chit和anti gp160均不导电且分子较大, 阻抗增加, 显著阻碍了CuL的电子传递效率。当在底液中加入1 mmol/L H2O2后, 还原峰增大, 氧化峰减小, 峰电位不变(图5c), 将电极在0.2% HSA中温育后, 电流无明显变化(图5d), 表明其对非特异性蛋白吸附很小;而将电极在50 μg/L gp160 溶液中温育30 min后, 电流明显减小(图5e), 电流减少值Δi0和gp160的加入量呈正比。将该传感器放入pH 4.0~ 8.0的PBS缓冲液中进行循环扫描, 电极的氧化还原峰电势随pH值的增加线性负移, 图5 免疫传感器测定gp160的循环伏安图

  Fig.5 Cyclic voltammograms of bare GCE(a), immunosensor(b), immunosensor(c), immunosensor after incubated with 0.2% HSA(d), and immunosensor after incubated with 50μg/L gp160(e) at 100 mV/s in pH 7.0 PBS containing 1 mmol/L H2O2ΔEpa/ΔpH=-52 mV/pH; ΔEpc/ΔpH=-54 mV/pH。由于CuL在电极反应中的电子得失数为2, 推测每个配位的富马酸含有2个COO-可得失H+。推断检测机理如图6:CuL在电极上被还原为Cu(0)L, 溶液中的H2O2通过扩散达到电极溶液界面, 将Cu(0)L氧化成CuL, 而自身被还原成H2O。当gp160和anti gp160发生免疫结合后, 免疫生成物阻碍H2O2到达电极表面的传质过程, 电极催化H2O2电流下降。

3.4 实验条件的优化

  优化了CuL和抗体在GCE电极表面的修饰条件。GCE在1 mmol/L CuL中浸泡后, 电流在0~10 h内不断增加, 10 h后不再增加, 说明此时CuL在电极表面吸附基本饱和。将得到的GCE|CuL表面固定nano Au/Fe3O4/Chit膜, 并于25 ℃在100 μg/L gp160抗体(试剂盒中贮备液浓度)溶液中浸泡, 0~7 h内电流不断下降, 7 h 后基本稳定, 说明抗体在金胶上吸附饱和。因此CuL和gp160抗体的浸泡时间分别选择10和7 h。

  图6 免疫传感器对gp160检测原理示意图

  Fig.6 Procedure of immunosensor for gp160 detection免疫反应受pH、H2O2、浓度、温育时间等影响。考察了免疫传感器在不同pH底液中对1.0 mmol/L H2O2的催化响应。研究发现, 峰电流在pH 3.5~7.0逐渐增大;pH>7.0后, 峰电流开始减小。因此,最佳pH值选择7.0。本传感器对H2O2响应迅速, 电流达到稳态仅需2 s, 明显快于纳米金修饰电极[10]。H2O2浓度在0.1~1.0 mmol/L范围内与电流响应呈良好线性关系;浓度再提高, 电流响应改变不大。所以, 本实验采用1.0 mmol/L H2O2。随着温育时间的延长, 催化电流的下降值Δi0随之增加, 当达到30 min后趋于稳定值, 说明此时电极表面免疫反应已经进行完全。这比一般的酶联免疫温育时间(50~60 min)缩短了2倍[13], 这是因为本方法基于一次性免疫分析, 较夹心ELISA法减少了二抗的加入。考察了电位对H2O2安培测定的影响, 当电位在-150 mV附近时, 就可以观察到H2O2在电极表面的还原, 电位负移到-400 mV, 电流大幅度增大。这是因为电位越负, 对H2O2还原驱动力就越大。当电位为-300 mV时, 安培响应达到一个平台。所以本传感器的最佳反应条件为: 在pH 7.0的PBS底液中, 1.0 mmol/L H2O2, 在37 ℃(试剂盒标示反应温度)下温育30 min, 电解电位为-300 mV。

  3.5 Fe3O4磁性粒子尺寸与磁性对金胶及抗体的吸附影响

  考察了粒径为50, 100, 200, 300和400 nm的Fe3O4微粒在相同条件下吸附纳米Au的情况。TEM研究发现, Fe3O4微粒粒径越大, 负载的纳米Au越多, 且吸附的抗体也越多;但是如果金磁微粒粒径过大, 电极表面Chit膜固定后, 循环伏安扫描50~100次后容易脱附, 造成电流响应急剧下降。比较发现Fe3O4微粒粒径为200 nm时合成的金磁微粒在电极表面扫描后不容易脱附, 且可负载10~20个直径约为30 nm纳米Au。Crumbliss等[18]研究发现, 小尺寸的金胶(~30 nm)能给予蛋白质更多的取向自由度, 从而增加辅基靠近金胶的机会, 使电子方便地通过金胶的传输通道。而本实验合成的单分散nano Au/Fe3O4上金胶直径约为30 nm, 故具有较好的抗体包被和电子传输能力。由于Fe3O4具有超顺磁作用, 彼此容易发生团聚而使得电极上的纳米界面丧失, 且随着尺寸变小团聚速度加快[17], 本实验中, 50~100 nm金磁微粒在Chit膜中30 min内会发生团聚, 引起电流响应变小;而对于粒径>200 nm的金磁微粒,团聚效果较小, 在Chit中分散7 d后也很少团聚, 且制备的传感器电流大小不变。因此选用200 nm粒径的单分散Fe3O4微粒负载纳米金并包被抗体。

  3.6 多种免疫传感器对HIVgp160的安培测定比较

  在优化条件下, 传感器温育后安培响应的降低百分率与gp160浓度呈良好的线性关系, 线性范围为1~400 μg/L, r=0.9960, 检出限为0.5 μg/L(3σ), 与化学发光ELISA法相当(0.2 μg/L, 0.5~350 μg/L)[3], 明显优于酶联免疫吸附比色法(2 μg/L, 5~150 μg/L)[2]。但是本法较上述方法简便快速、价廉。分别比较了本电极(GCE|CuL/nano Au/Fe3O4/Chit/anti gp160)和抗体包被的纳米金修饰电极(GCE|CuL/nano Au/Chit/anti gp160), 以及抗体包被chit膜电极(GCE|CuL/Chit/anti gp160)对不同浓度gp160的检测效果。结果表明, 在相同制备条件下, 本电极对gp160检测灵敏度(2.5 A·L/g·cm2)最高, 金纳米修饰电极和chit膜电极分别为0.7和0.2 A·L/g·cm2), 测定范围也较后二者(1~250 μg/L和2~100 μg/L)宽近1~2倍。这是因为每个金磁微粒上有多个纳米金, 其在电极表面形成单分子层时比纳米Au有更多的gp160抗体固定点, 所以本研究传感器灵敏度更高, 检测范围更宽。

  将本电极在4 ℃储存于pH 7.0的PBS 溶液中45 d 后, 其对50 μg/L gp160安培响应降低6.5%, 说明该传感器具有较好的稳定性。

  3.7 干扰实验、耐用性和电极表面再生

  以50 μg/L gp160为比对标准, 依次加入8.8 mmol/L 葡萄糖, 0.24 mmol/L 尿酸, 0.5 mmol/L 抗坏血酸(人血清中主要组分的正常浓度水平), 研究表明响应电流变化很小(<10%), 证明该传感器具有良好的抗干扰性。采用同一电极测定50 μg/L gp160 30次后电流下降值<7%。继续测定会使少量血清蛋白吸附在电极表面, 导致电流减小, 但随后将电极在含有0.1 mol/L的盐酸胍PBS底液中浸泡12 h, 抗原从抗体上脱附, 其电流即可恢复到未使用前状态。因此可用盐酸胍PBS浸泡使电极表面再生。

  3.8 加标回收实验

  在正常人血清中加入了6~10 μg/L gp160标准品, 取1 mL样本溶解在5 mL电解质中, 采用本方法进行测定,并与标准EILSA法对比, 结果见表1, 吻合性较好。本方法的加标回收率为95%~102%, 表明本传感器适用于血清中HIV gp160含量的测定。表1 血清样品中HIV gp160检测结果(n=7)

  评论这张
 
阅读(62)| 评论(0)
推荐 转载

历史上的今天

在LOFTER的更多文章

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2017