注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

Calphostin C抑制酶修饰低密度脂蛋白诱导的内皮单核细胞黏附  

2015-07-11 23:35:48|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

【摘要】  目的 探讨酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL)诱导内皮单核细胞黏附的机制及Calphostin C的干预效果。方法 采用体外培养和直接计数法观察荷脂ECV304内皮细胞黏附能力的变化;PepTag○RAssay法定性内皮细胞胞膜蛋白激酶C(PKC)活性状态;RTPCR和Western印迹检测细胞间黏附分子1(ICAM1)和抑制性蛋白κBα(IκBα)表达的变化。结果 ELDL呈剂量依赖性增强内皮单核细胞间的黏附,其活化内皮促进黏附的理想剂量为20~40 μg/ml浓度。另外,ELDL还可显著活化内皮细胞胞膜PKC,下调IκBα的表达而增强ICAM1的表达。应用PKC特异性抑制剂Calphostin C干预后,荷载25 μg/ml ELDL 8 h的ECV304内皮细胞ICAM1表达下调而IκBα则反相上调,黏附能力也在Calphostin C达到100 nmol/L浓度时显著下调,细胞状态明显好转;且200~400 nmol/L Calphostin C基本可以逆转ELDL对内皮细胞的影响。结论 内皮细胞黏附能力的强效促进剂ELDL可能是通过PKC/NFκB/ICAM1发挥作用的,针对PKC靶酶的特异性抑制剂Calphostin C可以有效地抑制由ELDL引起的内皮活化黏附增强。

【关键词】  Calphostin C;低密度脂蛋白,酶修饰;细胞间黏附分子1;黏附;内皮细胞

单核细胞与血管内皮细胞、平滑肌细胞的黏附是动脉粥样硬化性心脑血管病的重要早期事件〔1〕,探讨病理状态下细胞与细胞间的黏附机制,并进而采取相应的干预措施,尤其是早期的药物干预,将会有效地预防该类疾病的发生。为此,本研究拟在课题组前期高脂血症影响内皮功能、促进脂纹和斑块形成的基础上〔2〕,以酶修饰的低密度脂蛋白(ELDL)处理ECV304人脐静脉内皮细胞,观察其黏附能力及相关指标,细胞间黏附分子1(ICAM1)、抑制性蛋白κBα(IκBα)和蛋白激酶C(PKC)的改变,并进而以PKC的特异性抑制剂Calphostin C进行相应干预,试图为黏附干预药物的体外研究奠定基础。

    1  材料与方法

    1.1  材料与试剂  THP1单核细胞和ECV304脐静脉内皮细胞(购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库);Calphostin C(购自Biomol公司)。总RNA提取试剂盒TRIzol(购自上海Sangon公司);ImPromIITM Reverse Transcriptase、PepTag○RNonRadioactive PKC Assay Kit 和BCATM Protein Assay Kit(购自Promega);MasterMix一管便捷式PCR扩增试剂盒(购自北京天为时代);所有引物(由上海生工生物工程服务有限公司合成);IκBα和ICAM1一抗,Western印迹Luminol Reagent(购自Santa Cruz);辣根过氧化物酶标记二抗(购自武汉博士德生物工程有限公司);其他试剂均为进口或国产分析纯。

    1.2  低密度脂蛋白(LDL)的分离、酶修饰及鉴定  参考文献〔3〕的方法制备ELDL。取新鲜人血浆100~200 ml,加入PDB以防腐抗氧化。置超速离心机作序列超速离心。提纯的LDL在含200 μmol/L EDTA的磷酸缓冲液(PBS)液中透析48 h后,加入胰蛋白酶(6.6 μg/ml)和胆固醇脂酶(40 μg/ml)共孵育48h后,获得ELDL。BCA法蛋白定量,鉴定后过滤除菌,调蛋白浓度至1 g/L,4℃保存,1 w内使用。

    1.3  实验分组  本研究分为两个部分,首先以ELDL浓度梯度(0、5、10、20、40 μg/ml)处理ECV304内皮细胞8 h。在观察到内皮细胞黏附功能和胞膜PKC活性的变化后,为了进一步明确ELDL诱导黏附的可能机制以及PKC和黏附的关系,遂以PKC的特异性抑制剂Calphostin C 处理荷载ELDL的ECV304内皮细胞。分组情况:①25 μg/ml ELDL +10 μl DMSO孵育细胞8 h;②25 μg/ml ELDL+25 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h;③25 μg/ml ELDL+50 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h;④25 μg/ml ELDL+100 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h;⑤25 μg/ml ELDL+200 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h;⑥25 μg/ml ELDL+400 nmol/L Calphostin C孵育细胞8 h。加入处理因素后每组细胞均在距20 W Philip荧光灯10 cm处照射大约30 min,以激活CalphostinC的药物活性。

    1.4  细胞黏附实验   参考文献〔4〕并加以改进。向生长于24孔板并融合至80%的ECV304细胞中分别加入上述处理因素培养8 h后,加入4×106个/mlTHP1单核细胞悬液800 μl/孔,37 ℃孵育30 min,吸弃培养基,预热PBS洗2次去除未黏附细胞,4%多聚甲醛固定细胞,显微镜计算机图像分析系统计数黏附细胞,方法为每个孔分别计数上、中、下、左、右每个视野的ECV304和THP1细胞数,5个视野单核细胞数/内皮细胞平均后即得到各个孔每个视野每个ECV304内皮细胞黏附的THP1单核细胞数目。试验重复3次。内皮细胞的黏附能力(Adhesion ability)用每个内皮细胞黏附的单核细胞数目来表示。

    1.5  PepTag○RAssay  参照文献〔5〕进行。将经过处理8 h的ECV304细胞分别提取胞浆胞膜蛋白。BCA蛋白检测试剂盒定量后按照PepTag○RAssay Kit说明进行如下操作。取9 μl胞膜蛋白粗提液加入到16 μl经过30℃ 2 min的PKC活性检测反应液,混匀后构成25 μl的反应体系(阴性对照则将9 μl未变性胞膜蛋白的粗提液替换为9 μl去离子水);30℃ 30 min,95℃ 10 min。4℃避光保存。取5 μl反应终产物0.8%的琼脂糖凝胶100 V的电压条件下水平电泳15 min。终止电泳后UVP凝胶电泳分析系统摄像,显示胞膜PKC磷酸化与非磷酸化条带。

    1.6  逆转录聚合酶链反应RTPCR  用TRIzol试剂提取经过1.3处理细胞的总RNA,溶于无RNA酶水中,紫外分光光度计测定OD260/OD280的比值在1.8~2.0之间。取总RNA 2 μg,用ImPromIITM Reverse Transcriptase合成cDNA,再取逆转录产物10 μl进行PCR循环。ICAM1引物序列5′CAGTCACCTATGGCAACGAC3′(正义),5′ATTCAGCGTCACCTTGGCTC3′(反义),243 bp;βactin 引物序列 5′ATCCCTGTACGCCTCTGG3′(正义),5′TCCTTCTGCATCCTGTCG3′(反义),500 bp。PCR反应条件为:95℃ 5 min预变性,95℃ 30 s变性,60℃ 30 s退火,72℃ 1 min延伸,35个循环,72℃ 5 min继续延伸。IκBα引物:5′CGTTCCTGCACTTGGCCATC3′(正义),5′GTCCGGCCATTACAGGGCTC3′(反义);94℃ 30 s,55℃ 45 s,72℃ 1 min,共32个循环,409 bp。反应结束后,取RTPCR产物在1.2%的琼脂糖凝胶中电泳,加样量均为10 μl,溴化乙锭染色。电泳条带采用UVP凝胶图像分析系统做积分吸光度测定和分析,以各组目的基因与内参照基因吸光度值的比值来比较待测基因mRNA的表达差异。

    1.7  Western 免疫印迹检测  提取经过处理的细胞总蛋白,BCA蛋白定量并煮沸变性后,参考文献〔6〕进行IκBα和ICAM1的蛋白免疫印迹检测。蛋白条带采用UVP凝胶图像分析系统分析。以对照组的面积灰度值为100%,与实验组进行比较和半定量分析。

    1.8  统计学处理  数据用x±s表示,组间比较采用方差分析及t检验,由SPSS11.0统计软件完成。

    2  结  果

    2.1  ELDL增强内皮单核细胞的黏附  倒置生物光学显微镜下可见未加处理因素的对照组内皮细胞呈胖梭形铺路石样外观,单核细胞小圆形、透亮,生长状态良好。用ELDL37℃孵育8 h后,ECV304内皮细胞黏附的单核细胞数目明显增加;细胞计数显示ELDL呈剂量依赖性的方式增强内皮单核细胞的黏附。由表1可见:随着ELDL浓度由0上升到20 μg/ml,内皮细胞的黏附能力也增加了2.5倍;但20 μg/ml ELDL处理组与40 μg/mlELDL处理组内皮细胞的黏附能力差异不显著(P>0.05),显示该浓度的处理已使内皮细胞的黏附能力进入到了一个相对稳定的平台期。

    2.2  ELDL促进内皮细胞PKC的活化  随着ELDL浓度的增加,ECV304内皮细胞PKC活性的磷酸化区带亮度越来越强。不过在20 μg/mlELDL处理组与40 μg/mlELDL处理组内皮细胞PKC活性基本趋于稳定(图1)。

    2.3  ELDL影响黏附相关因子IκBα和ICAM1的表达  ELDL抑制IκBα mRNA的表达(呈剂量依赖性的方式),促进ICAM1mRNA的表达(图2,表1)。但在5、10和20 μg/ml ELDL处理组间ICAM1mRNA的表达差异不显著(P>0.05)。Western印迹结果显示ELDL处理对ECV304内皮细胞IκBα和ICAM1表达影响的整体趋势与RTPCR结果基本吻合。

    2.4  Calphostin C抑制荷载ELDL内皮细胞黏附能力的增强  倒置生物光学显微镜下可见随着Calphostin C浓度的增加,荷载25 μg/mlELDL 8 h的ECV304内皮细胞开始由瘦梭形转变为胖梭形,胞浆内脂滴等异常物质的蓄积也开始减少。当Calphostin C浓度增至100 nmol/L时,黏附单核细胞的能力明显降低(表2),细胞状态也明显好转;当Calphostin C浓度增至400 nmol/L时,内皮细胞的黏附能力基本被逆转至未荷载ELDL的基线水平之下(P<0.01)(图3,表1和表2)。

    2.5  Calphostin C抑制ELDL对IκBα和ICAM1mRNA影响  随着Calphostin C浓度的增加,荷载25 μg/mlELDL 8 h的ECV304内皮细胞IκBα mRNA的表达上调,ICAM1 mRNA表达下调,而且这种上调或下调在200~400 nmol/L CalphostinC时基本趋于稳定,25 μg/ml ELDL+200与400 nmol/L CalphostinC两组间表达无显著差异(P>0.05)(表2和图4)。 表1  ELDL对细胞黏附能力及IκBα和ICAM1 mRNA表达水平的影响表2  Calphostin C对荷载ELDL的ECV304内皮细胞黏附能力及IκBα和ICAM1 mRNA表达水平的影响(x±s)

    3  讨  论

    细胞黏附是多种急慢性心血管疾病(如动脉粥样硬化、血栓形成、缺血再灌注损伤、经皮腔内血管成形术后再狭窄)、转移性恶性肿瘤等发生发展的重要环节。已有研究显示:在众多始动黏附的危险因子中,ELDL是最强效也最直接的动脉粥样硬化早期黏附事件的“推手”〔7〕。为此,在本课题的前期试验中,首先应用0~40 μg/ml的ELDL浓度梯度处理ECV304内皮细胞8 h探索其活化内皮促进黏附的理想剂量。结果显示ELDL促进内皮单核细胞黏附的理想剂量在20~40 μg/ml浓度范围内。该浓度的ELDL基本可使内皮细胞的黏附能力达到峰值而又不致产生明显的细胞毒性。

 鉴于不同的诱导剂在启动黏附的分子机制上存在较大的差异,以及ELDL强效启动内皮单核细胞黏附的具体机制尚未阐明,随后的试验又在酶学水平观察了与肿瘤转移、动脉粥样硬化早期黏附事件密切相关的PKC活性的改变情况。PepTag○RAssay法的检测结果显示ELDL呈剂量依赖性的方式增强ECV304内皮细胞胞膜PKC的活性,这一改变趋势同ECV304内皮细胞的黏附能力基本一致。进一步基因水平的研究显示ELDL还下调IκBα的表达、上调ICAM1的表达。已有的其他研究显示:在动脉粥样硬化的早期病变内膜下,蓄积的细胞中有大约80%是单核巨噬细胞;而这些单核巨噬细胞中又有70%左右是由ICAM1和P选择素所介导黏附至内皮上的〔8〕。但仅依据本研究的上述试验结果尚不足以说明ELDL诱导的内皮单核细胞黏附就是通过ICAM1表达的变化或PKC活性的改变来介导的。为此,在前期20~40 μg/ml ELDL是诱导内皮细胞黏附活化理想剂量的前提以及PKC酶活性变化趋势与内皮细胞黏附能力改变相一致的情况下,作者选择了PKC的特异性抑制剂Calphostin C作用于荷载25 μg/ml ELDL 8 h的ECV304内皮细胞,试图发现ELDL诱导黏附的相关机制,并为筛选黏附抑制药物奠定基础。

    研究结果显示当应用Calphostin C至100 nmol/L时,ECV304内皮细胞黏附单核细胞的能力开始显著下降,当增至400 nmol/L时内皮细胞的黏附能力基本被逆转至未荷载ELDL的基线水平之下(证明ELDL对内皮细胞黏附能力影响是通过活化PKC实现的);而且意外的发现应用Calphostin C后细胞状态明显好转,这种状态的好转要早于黏附能力的下降。那么这种对PKC活性的抑制是如何影响内皮细胞黏附状态的呢,后续试验显示Calphostin C可以抑制ELDL诱导的ICAM1和IκBα的改变,亦即ICAM1和IκBα的改变是继发于PKC活性的变化。结合已有的ICAM1启动子区存在NFκB结合位点的试验依据〔9〕,不妨认为ELDL共孵育8 h后,内皮细胞PKC被激活,激活的PKC下调了NFκB的抑制物IκBα,从而使NFκB活性增强,发生核浆转位。进入胞核的NFκB与ICAM1启动子区结合进而发挥转录上调作用,最终促进ICAM1表达增强、内皮黏附能力的上升。对ELDL诱导黏附机制的研究最终目的是为体外探索黏附抑制药物做准备。本课题对Calphostin C浓度梯度的研究显示200~400 nml/L为Calphostin C抑制并逆转ELDL诱导内皮单核细胞黏附的理想剂量,该剂量可以使发生变性的内皮单核细胞重新恢复良好的生长状态。

    综上所述,动脉粥样硬化早期黏附事件的强效促进剂ELDL可能是通过PKC/NFκB/ICAM1发挥作用的,针对PKC靶酶的特异性抑制剂Calphostin C可以有效地抑制由ELDL引起的内皮活化黏附增强。后续试验如果能进一步的观察Calphostin C作用于血管内皮的药代动力学特性,有可能会为这个用于治疗恶性肿瘤的药物开辟新的临床适应证。

  评论这张
 
阅读(71)| 评论(0)
推荐 转载

历史上的今天

在LOFTER的更多文章

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2017