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“血红蛋白A2 现象”的发现和研究——细胞成分“电泳释放”研究的开端  

2015-08-28 22:12:32|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  血红蛋白A2 现象 细胞成分 电泳释放

血红蛋白A2(HbA2)已被发现多年,但是,它的生理意义迄今不明。本文在长期的血红蛋白(Hb)研究中发现“HbA2现象”(秦氏现象),并对其出现规律、发生机制、临床意义等进行系列研究,得到一些初步结果,本文提出其生理意义的初步假说,作为阶段小结,进一步的研究仍在继续之中。

  1 HbA2概述

  人体红细胞中HbA2的含量很少,它是正常成人Hb中的次要成分。HbA2的结构已经清楚,理化性质也比较明确,只是它的生理意义尚不明了。“HbA2现象”对于HbA2是比较特异的,即HbA2必须含有δ链的Hb参加与其结构中。初步实验证明,红细胞中HbA(至少有一部分)是与HbA2结合存在,这种复合物可能再与红细胞膜上磷脂类物质相互作用,形成比较复杂的系统。这个系统也许有利于Hb执行其生理功能,也可能有利于红细胞完成其生理使命。我们有幸遇到一个临床诊断不明的病例,他的“HbA2现象”异常(秦氏病),似乎支持上述假说。

  1995年前后,国际上开始出现“蛋白质组学”(Proteome)这个概念,极大地推动了蛋白质的研究。我们于1981年发表关于“HbA2现象”的第一篇文章,1990年推出“HbA2现象”专辑,那时还没有“蛋白质组学”这个名称。现在看来,我们的工作属于蛋白质组学范畴,或者是它的开端,而且是“动态”蛋白质组学的开端。

  2 HbA2的结构特点

  HbA2是由Kunkel和Wellenius在1955年发现的[1],后来,Ingram和Stretton于1961年证明这种Hb的α珠蛋白链与HbA者完全相同,其非α珠蛋白链与HbA的β链不同,命名为δ链[2]。这样,HbA2粗结构应为αA 2 δA2 2。δ链与β链不同,但是差异不大,即在146个氨基酸中只有10个不同,具体如下:

  N…9…12…22…50…86…87…116…117…125…126…C

  NAA6A9B4D1F2F3G18G19H3H4HCβ链丝苏谷苏丙苏组组脯缬δ链苏 天胺丙丝丝谷胺精天胺谷胺甲 由以上比较中可以看出,这两种多肽链之间有如下差异:(1)HbA2与HbA的净电荷不同,主要来源于β22谷→丙、β116组→精;(2)β125亚氨基酸(脯胺酸)→非亚氨基酸(谷氨酰胺);(3)β126非含硫氨基酸(缬氨酸)→含硫氨基酸(甲硫氨酸);(4)δ链比β链多4个酰氨基,即δ12天-NH2、δ87谷-NH2、δ117天-NH2及δ125谷-NH2。这些差别的意义尚不清楚。这4项差异各有特点,不容忽视。特别是第4项,多出4个酰氨基,值得注意。

  3 HbA2的理化性质及其临床意义

  如前所述,HbA2是正常人红细胞中的次要Hb成分,它的等电点比较高,所以在碱性缓冲液中电泳时向HbA的阴极移动。在整个正常成人Hb中,HbA2的含量较少,但它在红细胞中是均匀分布的。除了电泳行为外,HbA2的层析性质也不同于HbA。在抗原性方面,HbA2也比HbA强。另一方面,HbA2的某些性质与HbA没有差异,例如氧亲和力、与DPG的结合能力等。一般认为,HbA2没有特殊的功能,支持这一观点的理由是携带δ链异常Hb的人,几乎都没有临床表现[3]。

  在正常成人Hb总量中,HbA2约占2.5 %左右。患某些疾病时,此数值可能有较为明显的变化。与HbA2增多有关的疾病中,最常见的是β地中海贫血。测定HbA2含量对于该疾病的诊断很有意义。此外,患β链异常的不稳定Hb病时,也可能出现HbA2相对增多。HbA2减少的疾病有α地中海贫血、Hb Lepore综合征、β δ地中海贫血等。与A2增多或减少有关的疾病参见表1[3]。

  表1 HbA2与各种疾病

  HbA2水平增高的疾病HbA2水平降低的疾病⒈杂合子β地中海贫血⒈遗传性胎儿Hb持续增多症⒉纯合子β地中海贫血⒉严重缺铁性贫血⒊疟疾⒊α、δ或β δ地中海贫血⒋恶性贫血及叶酸缺乏⒋Hb Lepore综合征⒌唐(Down)氏综合征⒌α链或δ链异常Hb病⒍病毒性肝炎⒍幼年型骨髓性白血病、红白血病⒎β链异常不稳定Hb⒎含铁母红细胞贫血⒏风湿性心脏病、急性风湿热⒏再生障碍性贫血⒐甲状腺机能亢进⒐D-三体综合征4 “HbA2现象”的发现及其基本概念

  人类以及所有脊椎动物的红细胞中都有Hb,这早已是众所周知的事情。但是,这项知识几乎都是来源于下述操作:用某种手段使红细胞破坏(溶血)、除去细胞膜成分、做成溶血液(Hemolysate)。然后使用各种方法来分析溶血液中的Hb,从而得知其许多性质,其中包括电泳行为等。溶血液中的Hb是否就是红细胞中Hb的真实反映?不容易答复。

  有人用红细胞进行过“细胞电泳”[4],此时是观察红细胞本身的迁移率,这样比较生理、病理条件下的差异时,Hb并不离开红细胞。Matioli和Niewisch做过单细胞(红细胞)凝胶电泳,用显微镜进行观察[5]。此时红细胞经过溶血处理、但不除去细胞膜成分(未做溶血液),Hb离开细胞(膜),也能看到大、小两个红色斑点。但是,在显微镜下,人们不容易将Hb溶液注射到单个红细胞的旁边,来平行对比二者Hb电泳行为的差异,所以大家都认为它们就是用Hb溶液作试验时所得到的HbA和HbA2。

  我们在长期的Hb研究过程中,由于淀粉-琼脂混合凝胶电泳分辨率比较高、操作相对简单,故用全血直接筛查异常Hb,并得到良好效果,筛查标本量超过60 000份。但是,所用血液几乎都是别人的剩余血,放置时间长短不一,陈旧程度不同,有时看到HbA2电泳速度参差不齐,但HbA却都在同一水平线上。这种特殊情况引起了我们的注意,我们怀疑这是血液中红细胞溶血程度不同造成的。为了弄清问题,我们将正常成人红细胞与其本身的溶血液并排电泳,观察而这二者有何差异。结果发现,二者的“HbA2”位置明显不同。这就是“HbA2现象”的基本事实。

  “HbA2现象”的内容如下:将正常成人红细胞的生理盐水悬浮液与其本身的溶血液(生理盐水+CCl4)并排电泳。此时,二者的HbA、碳酸酐酶(CA)电泳位置相同,只有“HbA2”特殊,即二者的HbA2不在同一位置。与溶血液中HbA2相比,红细胞没有与其相对应的成分。但是,在相当于溶血液HbA2的稍前方(阳极侧)出现一个红色区带(联苯胺染色也阳性),我们称其为红细胞HbA2或RBC-HbA2。这个区带的特点是:(1)不整齐,不像溶血液中HbA2那样集中;(2)HbA与它之间的“拖尾”相当明显。给人留下的印象是:红细胞中的HbA2与HbA,似乎不易分开,而溶血液中的HbA2与HbA则分离较好、界限比较清楚。必须指出,红细胞与其溶血液比较,其它成分之间(HbA与CA、HbA2与CA)没有看到这种现象,或者极不明显。此外,在原点(加样处)也有一点差异:溶血液者此处没有任何痕迹,红细胞者这里留下少量红色沉淀,而且有一些向阳极方向的“拖尾”[6]。

  “HbA2现象”主要是“红细胞HbA2”与溶血液HbA2在电泳行为方面的差异,就是“红细胞HbA2”所显示的那种特殊现象。换句话说,任何化学成分在细胞与胞质之间出现电泳行为的差异,都可以称为“HbA2现象(广义)”,或简称为“A2现象”。这就是“HbA2现象”的概念和范畴。

  5 “HbA2现象”与结构的关系

  “HbA2现象”被发现后,我开始研究一些异常Hb标本的“HbA2现象”与各种异常链变异物的关系。

  5.1 β链异常Hb与“HbA2现象” 我们首先观察含有β链异常Hb的样品有没有“HbA2现象”。我室所遇到的β链异常Hb有HbN-包头、HbD-包头及HbE等。结构分析证明,HbN-包头为HbJ-Lome[β59(E3)lys→Asn],包括一系列电泳行为相同的变异物质,其中包括:HbD-Los Angeles[β121(GH4)Glu→Gln]、HbG-Taipei[β22(B4)Glu→Gly]、HbG-Coushatta[β22(B4)Glu→Ala]等。HbE结构是β26(B8)Glu→Lys。我们用这些结构异常的β链变异物血液样品进行了“HbA2现象”分析。从实验结果看,检测过的样品中,β链异常Hb本身都没有HbA2所显示的那种特殊现象,也就是说,这些β链异常Hb本身在溶血液与红细胞电泳结果方面没有差别。但是,含β链异常Hb的红细胞中,其“红细胞HbA2”仍有前述HbA2现象,未受影响。

  β链异常Hb本身没有“HbA2现象”,但是它可能帮助我们解决一些溶血液不能解决的问题。本文中HbE杂合体血样的结果就是一个例子。众所周知,HbE的电泳及层析行为与HbA2者非常相近,甚至相同,鉴别起来很困难。在这种情况下,人们常常采用HbA2电泳成分的定量结果(%)来判定其为HbA2或HbE。例如,Lehmann主张,此Hb成分超过10 %时就可以认为它是HbE,此数值以下者为HbA2[7]。但是,后来Vella报告一例地中海贫血病人,其HbA2竟达15 %之多[8],可见靠百分浓度来确定HbE或HbA2是不够严格的。所以Lehmann也曾指出,遇到疑难病例时,鉴别这两种Hb的唯一有效办法还是“指纹技术”[7]。现在看来,本文的实验结果提供了一种简便方法,即用“HbA2现象”实验可以比较容易地区分开HbE和HbA2,若是HbA2就应当有“HbA2现象”;若是HbE就没有这种现象[9]。

  5.2 α链异常Hb与“HbA2现象” α链异常Hb与β链异常者不完全一样。这种异常Hb有两个异常成分,即HbA与HbA2都有其对应的变异物质,HbA的异常分为αX 2 βA 2、HbA2的异常成分为αX 2 δA22。这部分工作中,我们使用了3种α链异常Hb:HbG-Taichung[α74(EF3)Asp→His]、HbQueens[α34(B15)Leu→Arg]和HbI-Baotou(结构待定)。实验结果表明,α链异常Hb的主要成分αX 2 βA 2(本文中的αG 2 βA 2,αQu2 βA 2及αI 2 βA 2)与β链异常HbαA 2 βX 2相同,都没有“HbA2现象”[10]。但是,α链异常Hb的次要成分αX 2 δA22(本文中的αG 2 δA22,αQu2 δA22及αI 2 δA22)则表现出红细胞与溶血液之间有差异,也就是说,这些次要异常Hb成分都有“HbA2现象”。

  前边提到,“HbA2现象”发现于正常成人红细胞和溶血液的“HbA2”。现在,我们又看到α链异常Hb的次要成分αX 2 δA22也有这种现象。众所周知,αG2 δA22、αQu2 δA22及αI 2 δA22都属于HbA2的α链变异物质,它们都表现出A2现象。说明HbA2中αA变成αG、αQu或αI时,并没有影响到出现HbA2现象。α链异常Hb有一系列特点,例如,它有主要与次要两个异常成分;它们的电泳位置与HbA与HbA2的位置相对应;其主要异常成分的含量明显少于HbA,次要成分也明显少于HbA2(二者的含量关系是对应的)等等[11-13]。现在根据我们的实验结果,可以再增加一项新的特征:α链异常Hb的次要成分有“HbA2现象”,而其主要成分则没有这种现象。

  5.3 δ链异常Hb与“HbA2现象” 为了进一步探讨α链异常及β链异常Hb的“HbA2现象”,我们又专门研究了δ链异常Hb的“HbA2现象”[14]。这里使用了3种δ链异常Hb:HbA2-Liangcheng(凉城)[δ117(G19)ASN→ASP(AAC→GAC)]、HbA2-Saihan-tala(赛汗塔拉)和HbA2-Xisu(西苏),前者来自汉族家庭、后二者来自蒙古族家庭。3种δ链异常Hb的研究结果表明,它们都有“HbA2现象”。这使我们对于“HbA2现象”的认识又前进一步。

  5.4 “HbA2现象”与结构关系小结 根据以上工作,可以将成人Hb(包括正常和异常)就“HbA2现象”进行如图1的分类。

  “血红蛋白A2 现象”的发现和研究成人HbHbA2现象(+)-正常(成人)血红蛋白次要成分……HbA2(αA 2 δA22)

  异常(成人)血红蛋白δ链异常……HbA2-X(αA2 δX2)

  α链异常次要成分……HbX(αX2 δA22)

  HbA2现象(-)- 正常(成人)血红蛋白主要成分……HbA (αA2 βA2 )

  异常(成人)血红蛋白β链异常……HbA2-X(αA2 βX2)

  α链异常次要成分……HbX(αX2 βA2)

  图1 成人Hb依“HbA2现象”分类

  由这一分类情况可以看出,“HbA2现象”阳性的成人Hb,不论正常还是异常,其粗结构都是α2δ2,都属于HbA2系统。此项发现一开始就命名为“HbA2现象”,现在看来,这种提法还是比较合适的。“A2现象”阴性的成人Hb,不论正常还是异常,其粗结构都是α2β2,都属于HbA系统。HbA系统与HbA2系统都含有α链,但二者的“HbA2现象”结果不同。由此推测,在“HbA2现象”的产生机制中α链可能不会占有重要地位。另一方面,“HbA2现象”阳性Hb中都含有δ链、而阴性成分中都含有β链,自然推测:δ链很可能是产生“HbA2现象”的关键性多肽链。与此相反,β链对于“HbA2现象”也许是次要或者无关紧要的因素。

  如果δ链是产生“HbA2现象”的关键成分,首先应当考虑它的一级结构特点,尤其是它与β链的差异,本文在一开始处就列举了这两种多肽链在氨基酸组成及顺序上有10处不同,并且提出4组差异。这些差别在“A2现象”中的意义尚不清楚。初步认为,静电荷不同可能作用不大,因为HbE(静电荷与HbA2大致相同)没有“HbA2现象”。其它3项各有特点,不容忽视。特别是第4项,δ链比β链多出来4个酰胺基,值得注意。

  δ链与β链这些差别在“HbA2现象”中的意义虽不清楚,但是它可以提供一种解决实际问题的手段,即一种鉴别δ链与β链的新方法。众所周知,目前鉴别异常珠蛋白链的常用方法有血红蛋白分子杂交、对-氯汞基苯甲酸法、尿素解离法等,但都只能区分α链异常与非α链异常,他们并不能从本质(性质)上将非α链异常Hb再区分为β链异常或者δ链异常,此时只能依其它关系进行推断,如异常Hb含量很多(接近50 %)者应为β链异常,含量很少(1 %左右)时很可能是δ链异常Hb。这种区分办法一般没有问题。但如果遇到不稳定异常Hb,定量关系发生变化,有时会给判断异常链造成困难。现在,根据我们的研究,可以用“HbA2现象”来区分非α链异常成人Hb,即“HbA2现象”阳性者为δ链异常,阴性者为β链异常。这种方法简单,结论明确。“HbA2现象”与成人异常Hb异常链的关系参见表2。表2 “HbA2现象”与成人异常Hb异常链关系

  6 “红细胞HbA2”的化学组成

  “HbA2现象”关键是红细胞HbA2与溶血液HbA2不同,这种差异的主要表现是在电泳图像中,红细胞HbA2比溶血液HbA2泳速快(向阳极方向)。电泳速度快,应当首先考虑带电状态,也就是说红细胞HbA2的净电荷中负电性因素较溶血液HbA2为多。如果我们假定溶血液HbA2就是HbA2本身,可以认为,在红细胞中HbA2可能与某种负电性较强的物质X-结合存在,如式①。

  红细胞HbA2=HbA2++ X-=HbA2-X ①

  当然,这种结合应该是比较疏松的、在制备溶血液过程中二者可以分离,从而出现红细胞HbA2与溶血液HbA2之间的差异。

  还可以有另外一种假设:红细胞HbA2是HbA2本身,在制备溶血液的过程中它与红细胞中一种带较多正电荷的成分Y+结合,电泳时表现为溶血液HbA2与红细胞HbA2不同,而且溶血液HbA2出现在“红细胞HbA2的阴极侧。这一关系如式②。

  溶血液HbA2=HbA2-+Y+=HbA2-Y②

  在这里,无论X-或者Y+,都应当是存在于红细胞中(包括细胞膜上)的成分。如果这种成分是低分子化合物,它与HbA2结合不会因为分子量而影响红细胞HbA2或溶血液HbA2的电泳位置;这种成分若为高分子化合物,在分析凝胶电泳结果时还要考虑它对泳动速度的影响。为了验证上述假说,我们设计了以下有关实验[15]。

  6.1 红细胞HbA2的电泳分析 先用红细胞生理盐水悬浮液做一般“HbA2现象”实验,电泳中红细胞HbA2已经明显分离后,转角90°进行第二向电泳。此时红细胞HbA2分成两种Hb成分:一个相当于HbA、另一个在对角线的稍下方(第二向时速度减慢),它很可能就是溶血液HbA2。为了进一步明确上述关系,用淀琼电泳再做“HbA2现象”实验,结束后不染色,将Hb区带连同其凝胶一起留下,在玻璃板上留下4块含有红色区带的凝胶(来自红细胞的红细胞HbA2和HbA两个区带,以及来自溶血液的HbA2和HbA两个区带),切除其余无色淀琼凝胶。含红细胞HbA2的凝胶原位不动,将其它含Hb凝胶都推到前者的两旁(在玻璃板上滑动),并排在一条线上。它们的位置关系是:红细胞HbA-红细胞HbA2-溶血液HbA2-溶血液HbA。位置调好后,在它们的周围再倒上新的淀琼凝胶,厚度相当,放至室温,胶液凝固后再通电,条件同前。实验结果表明,红细胞HbA2仍能分成两个成分,它们的电泳位置与溶血液HbA2和HbA相对应。

  将这些结果与前述假设联系起来,可以认为实验结果支持关系式①,不符合关系式②。众所周知,HbA的负电荷多于HbA2,符合式①中对X-的要求。这就是说:X-=HbA,代入式①得:红细胞HbA2=溶血液HbA2-HbA

  现在看来,“红细胞HbA2”是溶血液HbA2与HbA的结合产物,也就是说,“HbA2现象”的产生机制就在于红细胞中这两种Hb之间的相互作用。由于二者结合存在,势必影响到结合产物的电荷和分子量。HbA2-HbA的负电性可以解释为什么红细胞HbA2快于溶血液HbA2(阳极方向)。至于红细胞HbA2区带的具体位置为什么仅仅比溶血液HbA2靠前一点,我们认为,此时要考虑两个问题:(1)红细胞HbA2的分子量,(2)“红细胞HbA2”的负电荷。HbA2-HbA的分子量大于HbA2,是否由于凝胶电泳的分子筛作用影响了它的泳速。结果恰恰相反,红细胞HbA2分子量大,但出现在溶血液HbA2之前,尚不能解释。是否因红细胞HbA2中HbA2∶HbA的比值不等于1,即下式③中n明显大于m(红细胞HbA2中HbA很少,负电荷增加不多)。这样,红细胞HbA2的电泳速度就只稍快于溶血液HbA2,从而解释我们所看到的“HbA2现象”。

  红细胞HbA2=(溶血液HbA2)n-(HbA)m③

  对(2)的上述答复是不肯定的。许多时候,可以明显看到n>m。此时,用电荷关系来解释电泳位置尚属可以。不过,有时我们还能看到另外一种情况,即n

  还有一个红细胞HbA2区带不集中、与HbA之间拖尾比较严重的问题需要讨论,我想从红细胞HbA2中两种Hb(溶血液HbA2与HbA)结合的不牢固情况谈起。现在已经比较清楚,由红细胞制备成溶血液,HbA2现象就消失。可见这种结合很不稳定,经过CCl4处理和震荡就遭到破坏。还有,第一次电泳后原位不动,第二次电泳(双向)时这种结合也要遭到破坏而解离出HbA2与HbA,说明它是相当不牢固的。再加上上述n与m关系的变动情况,可以推测在最初红细胞HbA2中HbA可能多于溶血液HbA2(即m>n),随着第一次电泳过程的进行,陆续有少量HbA脱离下来。电泳时间越长,脱离下来的HbA越多,最后变成n>m。HbA的不断脱落造成了区带不集中、连续脱落的少量HbA形成了明显的拖尾。

  如上所述,红细胞HbA2中的两种Hb的联系并非十分密切,随时都可互相分离,但不是两种蛋白质胶粒无规律的互相“黏附”。我们用各种异常Hb所做的“HbA2现象”实验,可以帮助说明问题。这些异常Hb,都与正常Hb杂合在同一红细胞中。在用这些红细胞做实验时,并非都能看到“HbA2现象”。从数量来看,绝大多数异常Hb(β链异常Hb和α链异常Hb的主要成分)的含量都明显多于HbA2,但它们与HbA之间没有“黏附”。所以我认为这不是无规律的“黏附”,是一种特异性的相互作用。

  总之,对于HbA2现象的机制,我们总算有了一些认识,尽管还不完善、甚至可能片面。我们很早就知道正常成人红细胞中含有HbA和HbA2等,但它们是如何存在、互相间有无联系则一无所知。现在看来,HbA2和HbA不是孤立存在于红细胞之中,而是彼此结合存在。不一定全部HbA都与HbA2结合,至少有一部分是这样的。这种结合并非十分密切,比较容易分离,所以过去没有被人发现。

  6.2 红细胞外HbA2与HbA间的相互作用 前文中提到,红细胞HbA2是HbA2与HbA的结合产物。但是,两种Hb的联系并非十分密切,一些处理(制备溶血液、双向电泳过程等)比较容易使它们彼此分离,涉及到是否来自互相“黏附”问题。我们根据过去的实验,推断二者间的联系并非来自“黏附”,还没有特异性相互作用的更直接证明。这一节将证明,在离开红细胞的特定条件下,HbA2与HbA也能发生相互作用。使我们对红细胞HbA2的认识再前进一步[16]。

  为了在红细胞外证明Hb之间的相互作用,作者采用了淀琼凝胶交叉电泳技术。先用溶血液做单向和双向交叉电泳,看这种情况下HbA2与HbA有无相互作用。然后,用提纯的HbA做实验,排除其他可能的干扰。最后,用血浆白蛋白与溶血液做交叉电泳实验,检验一下上述作用的特异性。首先是单向交叉电泳结果,当溶血液中HbA穿过HbA2时出现区带“扭曲”,说明二者之间发生了相互作用。当然,需要排除溶血液中非蛋白成分(泳速快于或稍慢于HbA、也能穿过者)的可能影响。然后是双向交叉电泳,第一次电泳时HbA已经与其它成分分开,第二次电泳时只有HbA与HbA2接触的地方出现特殊的“扭曲”图像。可见,是HbA,而不是其前后非Hb成分在起作用。用电泳提纯的HbA,再做此实验,进一步证实了这种想法,说明在HbA与HbA2之间确实存在“相互作用”。这种相互作用并非普遍存在于各种蛋白质之间,因为CA没有“HbA2现象”,单向交叉电泳中HbA穿过CA时也没有出现特殊图像,都已经说明了这个问题。但考虑到HbA和CA都是红细胞中的蛋白质,也许有局限性。我们又用血浆白蛋白进行实验,想用这种蛋白质泳速快的特点,使其穿过红细胞溶血液中的所有蛋白质,观察它的效果。实验结果表明,白蛋白与HbA、HbA2及CA都没有发生“相互作用”。到此,可以得出结论:在我们所做实验的范围内,HbA与HbA2的相互作用是特异的,说明红细胞HbA2中HbA2与HbA的结合可能来自二者之间的相互作用。

  经过上述系列研究,对于“HbA2现象”发生机制的认识,又前进了一步。我们不仅证明红细胞中HbA2与HbA结合存在,而且又证明脱离红细胞后这两种Hb在特定条件下仍能发生相互作用。这些结果使我们更加相信,HbA2与HbA不是孤立地存在于红细胞之中,而是通过特异的相互作用、比较疏松地结合在一起。

  7 HbA2 现象的与红细胞膜

  大家知道,“HbA2现象”是用红细胞做电泳引起的,溶血液没有这种现象,可见红细胞膜在产生“HbA2现象”方面也很重要。

  7.1 HbA2现象与溶血的关系 标准“HbA2现象”,使用的是完整红细胞和它的溶血液。如果用溶血的办法破坏红细胞膜,但是不除掉膜(仍留在原来溶液中),观察溶血产物中的红细胞残骸对“HbA2现象”有无影响[16]。此项工作中使用了两种最常用的溶血办法:(1)用蒸馏水使红细胞溶血;(2)用皂素使红细胞溶血。在常规“HbA2现象”实验方法的基础上,增加一项观察红细胞溶血产物有无“HbA2现象”。

  实验结果表明,溶血产物中虽未除去红细胞膜残骸,但是他已经失去标准的“血红蛋白A2现象”,或者这种现象已经减弱。但是,它与Hb溶液的结果也不一样,介于二者之间。这说明,“HbA2现象”的出现与红细胞膜有关,而且膜的完整性更加重要。由此可见,“HbA2现象”的发生机制是比较复杂的,既涉及到膜,又涉及到膜的完整性。

  关于Hb与红细胞膜的关联问题,文献上有过记载,但是还未能得出十分明确结论,更未涉及HbA2。1975年,Fischer等人曾经提出,Hb可能与正常及镰状红细胞的细胞膜相结合[17]。1977年,Shaklai等人也认为Hb可能与红细胞膜发生相互作用[18-19]。本文结果说明,“HbA2现象”支持“Hb可能是与红细胞膜关联蛋白”的概念。不仅如此,与红细胞膜发生关联的Hb不仅有HbA,还有HbA2,而且也许不是单独的HbA或者HbA2,可能是二者的结合产物(HbA2-HbA)。现在看来,红细胞膜与HbA2-HbA的联系,可能比HbA2与HbA的联系更疏松,电泳时更容易断裂并彼此分开。但是必须指出,尽管红细胞膜与HbA2-HbA的相互作用比较微弱,它在维系HbA2与HbA之间的联系上仍是重要的。如果红细胞膜遭到破坏、它与Hb的相互作用减弱,“HbA2现象”也受到影响。

  7.2 Hb与磷脂间的相互作用 “HbA2现象”来源于红细胞与溶血液之间的差异,进一步实验证明这种现象要求红细胞膜的存在和其完整性。红细胞膜的完整性涉及到膜上成分及其存在状态。作者用脑磷脂做实验,观察其与Hb之间有无相互作用。单向和双向交叉电泳以及HbA或HbA2与脑磷脂混合实验都证明脑磷脂可与Hb发生反应,而且HbA及HbA2都能与脑磷脂相互作用,产生的是既含Hb、又有脂类性质的复合物。这一细胞外实验支持红细胞膜中磷脂与Hb之间的相互作用,并且进一步提示,在红细胞中不仅HbA可能与磷脂结合,HbA2也可能与磷脂相互作用。这样,我们推测,在完整红细胞中,HbA2与HbA(至少是部分)结合,二者还与红细胞膜上的磷脂相互作用。在固态支持体中电泳时,HbA2-HbA与膜上磷脂脱离,表现出“HbA2现象”。现在的问题是脑磷脂表现出来明显的不均一性。脑磷脂最初是指由脑组织提取出来的一种不溶于醇类的磷脂组分。脑磷脂至少含有三种磷脂成分:磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)及磷脂酰肌醇(PI)[20]。本文作者利用纸上电泳方法,证明脑磷脂确实含有3种成分(电泳中出现3个区带,都是脂类染色阳性)。根据这些成分在脑磷脂中的含量关系(PE>PS>PI)以及它们所带电荷情况(以负电荷多少为序:PS>PI>PE),可以认为脑磷脂电泳结果中的3个区带为+PS-PI-PE-。

  实验证明,脑磷脂能与Hb可以在两种状态下相互作用:(1)脑磷脂与Hb直接混合;(2)二者在电场中相遇(交叉电泳时)。不仅如此,深入分析还表明,脑磷脂中的3个成分与溶血液中的两种Hb也都能彼此相互作用。因为他们作用产物都同时具有Hb和脂类特性。值得注意的是,虽然这3种磷脂都能与Hb发生相互作用,但在细节上并不完全相同。PS、PI与Hb的作用好像没有特异性。这里没有显示出HbA与HbA2的电荷差异:HbA-PS和HbA2-PS的电泳位置相近;HbA-PI和HbA2-PI也是泳速相同。与此相反,PE与Hb的作用似乎有特异性,HbA-PE和HbA2-PE的电泳位置不同,表现出HbA及HbA2的电荷差异。由此可见,脑磷脂与Hb的相互作用应该分为两种类型:PS、PI和PE型。

  有关细胞膜的知识告诉我们,红细胞膜分为内外两层(或者内外两个区):外层磷脂主要是鞘髓磷脂和磷脂酰胆碱,内层主要是磷脂酰丝氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。在磷脂与Hb相互作用方面,Szundi等[21]使用单分子脂层法研究了Hb与磷脂的关系,他们的结论是:与Hb发生相互作用的是内层磷脂,外层磷脂不起作用。本文所用的磷脂基本上都是内层磷脂,所得结论也与Szundi类似。不过,在红细胞膜内层两种磷脂与Hb相互作用的相对重要性方面,Szundi等强调了PS。本文实验结果表明,在相互作用数量方面,用溶血液所做实验中PE明显多于PS;两种Hb单独与磷脂作用时,HbA的结果是PS与PE大致相等(也许PS略微多于PE);HbA2的结果是PE明显大于PS,与溶血液的整体结果一致。由于Szundi等人没有区分HbA和HbA2,故无法与其比较。

  “HbA2现象”的机制研究结果表明,红细胞中至少有一部分HbA是以HbA-HbA2方式结合存在。通过溶血实验证明“HbA2现象”与红细胞膜有关。磷脂实验证明,这两种Hb都能与磷脂(P)发生相互作用,生成HbA-HbA2-P。不过,磷脂与Hb之间的相互作用,可能比HbA与HbA2之间的作用更弱一些,因此,前者在电场中可以分开,使HbA-HbA2脱离红细胞,表现出“HbA2现象”。是否红细胞HbA2=HbA-HbA2-P,从而影响其电泳速度才出现前述电泳位置不好解释的情况,由于脂类染色尚未成功,此问题尚待解决。

  8 “HbA2现象”与疾病

  在研究“HbA2现象”发生机制的同时,作者继续寻找它与疾病的联系。根据一例“HbA2现象”异常症[22],既初步实现了这种现象的直接应用,又促进了对其机制的进一步了解。患者被怀疑有地中海贫血或者有异常Hb,但诊断不明。实验室检查未见异常Hb,也未查出α或者β地中海贫血,但“HbA2现象”明显异常。红细胞电泳结果:HbA2几乎完全消失,没有溶血液HbA2,HbA明显减少,原点处留下大量沉淀(呈油脂扩散状,但蛋白质染色阳性)。根据上述结果,作者推测此时红细胞中HbA2-HbA复合物(红细胞HbA2)可能与膜上异常脂类成分(不是正常的磷脂成分)牢固结合,电泳时二者不能脱离,表现为原点沉淀、“HbA2现象”异常。作者曾在检查属于α地中海贫血的HbH病时能够看到红细胞HbA2,也研究过HbA2增多型β地中海贫血,其HbA2现象与正常人相同。现在看来,这个病例可能比较特殊,它的临床诊断不明,作者从实验室角度暂时命名其为“HbA2现象异常症”(秦氏病),以便今后批评、讨论和引用。

  发现“HbA2现象”以来,作者一直在寻找它的异常情况。因为一旦发现异常,不仅能够解决医学诊断方面的需要,而且可能有助于弄清这种现象的发生机制。“HbA2现象”异常可能有各种情况,例如红细胞HbA2的电泳速度异常,含量明显增多、明显减少或完全消失,原点成分显著增多等。在我们以前的实验中,曾经遇到原点成分显著增多但红细胞HbA2正常的病例,现在所报告的病例属于红细胞HbA2接近完全消失类型,并且在原点留有大量沉淀。这个病例的发现,使作者对于“HbA2现象”机制的认识又深化一步。我们在研究正常“HbA2现象”的发生机制时,曾经证明红细胞中HbA2与(至少)部分HbA结合存在,二者之间有相互作用。在本例中,“HbA2现象”异常,红细胞HbA2消失,HbA明显减少,原点出现大量油脂沉淀。患者的溶血液中HbA2含量很少(属于正常情况),如果只是它留在原点,沉淀物不应太多。另一方面,患者的溶血液中HbA含量很多(属于正常情况),而红细胞电泳结果中,HbA明显减少,原点处出现大量沉淀,而且蛋白质染色阳性。由此推测,原点沉淀很可能同时含有HbA2和HbA,也就是说,此时二者可能还是结合存在,但此时在电场作用下没有能够离开红细胞。由于原点沉淀呈油脂状,推测有脂类成分存在,蛋白质染色阳性说明有蛋白质存在,二者可能结合成脂蛋白。但是,前边推测这里有Hb(HbA和HbA2都有),由于当时未作脂类染色和联苯胺染色,是Lipid-Hb或者是脂蛋白与Hb的复合物不得而知。

  为什么HbA2-HbA没有冲出红细胞膜的包围?我们曾经提出“HbA2现象”可能与红细胞膜有关,现在看来可能是红细胞膜出现异常,至少由两种可能:(1)红细胞膜上的通路变窄,电泳时HbA可以通过,HbA2-HbA不能通过;(2)红细胞膜上的异常成分与HbA2-HbA结合牢固,电泳时后者未能脱离下来。红细胞膜的异常情况不明,但由于原点成分呈现“油脂扩散状”,估计是红细胞膜上脂类成分增多或者出现异常的脂类。我们曾经提出正常红细胞中HbA2-HbA与水溶性比较强的磷脂(P)结合存在(HbA-HbA2-P)的假说。现在可以认为,是否磷脂变成脂溶性比较强的成分(Y),并与HbA2-HbA比较牢固地结合在一起(变成HbA-HbA2-Y),无法与红细胞膜脱离。由于这是广西的患者,后来失去联系,有待再寻找这类患者,做进一步研究。

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