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lican8341的博客

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日志

 
 

人OAZ突变基因的克隆构建及重组蛋白表达  

2015-08-28 22:20:59|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的 构建人鸟氨酸脱羧酶抗酶(OAZ)突变基因,重组至原核表达载体中并表达出重组蛋白。方法 采用基因定点突变技术在OAZ基因TCCTGATG(199~206)位置造成第202位碱基T碱基缺失,使核糖体的阅读框+1移位,连续表达OAZ基因的ORF2部分。测序鉴定后,重组质粒转化BL21菌,进行突变基因的蛋白表达。结果 重组质粒经测序后确认202位碱基T缺失,其余碱基序列无变化。重组的突变基因转入BL21后在IPTG诱导下表达OAZ全长蛋白,SDS-PAGE分析在相对分子质量45 900左右出现新的蛋白条带。结论 成功构建人OAZ突变基因重组质粒,转化BL21后表达出融合的OAZ全长蛋白,为进一步研究其临床应用打下基础。  
【关键词】  鸟氨酸脱羧酶抗;突变;蛋白表达 
  鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)是多聚胺生物合成中的关键酶,催化多聚胺生物合成途径中的第一步——鸟氨酸向腐胺的转变。随后,腐胺再转变为亚精胺、精胺。ODC是该代谢途径的限速酶,在此过程中扮演着重要的调控酶角色,其活性可在转录、翻译和翻译后水平受到精确的调控。鸟氨酸脱羧酶抗酶(ornithine decarboxylase antizyme,OAZ)是在翻译后水平的一种调控形式,它可以连接到ODC蛋白上,抑制其催化活性并靶向地促使26S蛋白酶降解ODC,从而负性调控细胞内多聚胺含量。有研究表明,细胞内OAZ的过度表达在降低细胞内多胺水平的同时还能抑制细胞的生长。由此推测,OAZ在细胞的生长与分化过程中担任着重要的角色[1~3]。OAZ蛋白的表达有一个非常有趣的移位翻译现象,其表达受到精胺的一个称之为frame-shifting的核糖体移位的调控。多聚胺通过这种较罕见的调控机制诱导OAZ蛋白的生成,又反向抑制多聚胺在细胞内的浓度,使细胞在一个稳定的多聚胺水平进行正常生长分化。OAZ转录本的编码存在两个不同的阅读框,ORF1和ORF2。OAZ蛋白其实是一个由短的非保守的ORF1产物和高度保守的ORF2产物的组合。在OAZ mRNA的阅读框中,需要有一个+1的翻译移码过程。在ORF1的5′端终止密码子处,通常序列为TGCTCCTGATGCC(196~208)。翻译框架达到TGA时,如果没有精胺的存在,核糖体将接受TGA为终止密码子,翻译到此终止。当精胺浓度一定时,核糖体的翻译即可受到精胺的调控进行+1移码,跃过终止密码子TGA上的T,以GAT指导的天冬氨酸为后续,翻译合成ORF2[4-5]。翻译框架移码受到细胞内多聚胺水平上升的正调控,表达出的OAZ蛋白又能调节ODC的酶活性,反向调节细胞内多聚胺的水平,从而影响到细胞的生长及分化。在生长旺盛的肿瘤组织中,普遍发现了ODC的高表达,因此,OAZ蛋白特有的调控ODC活性的功能,就使之成为肿瘤免疫治疗的理想靶分子。但是,OAZ蛋白的表达受到精胺的诱导,缺乏精胺时,核糖体将不能进行+1的移位,翻译完整的全长OAZ蛋白。为此,本研究对OAZ基因进行了特定T碱基的缺失突变,成功构建至表达载体pET-32a中,测序确认后命名为pET-32a-OAZ-mutation,并在BL21菌中成功表达出OAZ全长蛋白,将对进一步研究该基因的功能以及以OAZ为靶点的肿瘤核酸疫苗的制备,具有重要意义。 
    1  材料和方法 
    1.1  试剂  大肠杆菌DH5α、BL21和表达质粒pET-32a、pET-32a-OAZ-wild质粒由本实验室保存。QuikChange定点突变试剂盒购自Stratagene公司。质粒纯化试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4DNA连接酶、XhoⅠ和EcoRⅠ内切酶均购自TaKaRa公司,其余生化试剂均为国产分析纯。 引物根据OAZ基因所需点缺失碱基处进行设计2条反向互补引物对P1与P2。 P1:5′-CCTCGGTGGTGCTCCGATGCCCCTCACCC-3′;P2:5′-GGGTGAGGGGCATCGGAGCACCACCGAGG-3′。 
    1.2  方法 
    1.2.1  反向PCR扩增  以pET-32a-OAZ-wild质粒为模板进行PCR 反应: 将pET-32a-OAZ-wild质粒(10 mg/L) 1 μl、dNTP 1 μl、10×Buffer 5 μl、P1与P2 引物 ( 100 mg/L)各2.5 μl、PfuTurbo DNA多聚酶(2.5 ×106 U/L) 1 μl、双蒸馏水37 μl 加入PCR 管; 95℃预变性30 s后, 95℃ 30 s、55℃ 1 min、68℃ 6 min ,共 18个循环。PCR 产物置于冰上2 min , 加入1.5 μl DpnⅠ内切酶(106 U/L), 37 ℃水浴2 h,酶解模板DNA。 
    1.2.2  转化大肠杆菌DH5α  取感受态大肠杆菌50 μl, 加入上述DpnⅠ处理液10 μl, 轻轻混匀, 冰浴30 min →42℃热休克45 s →冰上2 min,加入预热的LB 培养液0.5 ml, 置于37℃恒温摇床中, 200 r/min 振摇1 h。 
    1.2.3  质粒扩增、提取及鉴定  取200 μl 菌液铺到LB 琼脂培养板( 含Amp) 上, 37℃培养12~16 h。挑取单菌落,提取质粒。取质粒5 μl, 选取插入片段两端的酶切位点XhoⅠ和EcoRⅠ 双酶切,酶切产物经0.8%琼脂糖凝胶进行分析鉴定。含目的基因的质粒经测序验证目标碱基缺失后,命名为pET-32a-OAZ-mutation。 
    1.2.4  重组蛋白表达  将含有pET-32a-OAZ-mutation的质粒转化BL21菌,铺板挑阳性菌落并酶切鉴定为阳性菌落后,接种至含5 ml LB培养基中(含氨苄青霉素)振培过夜。次晨取100 μl接种至新的5 ml  LB培养基中,37℃振培3~4 h,至D值约为0.6时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5 mmol/L,继续培养2 h和4 h后取菌液1 ml,进行15%的SDS-PAGE电泳鉴定表达产物,以转染空pET-32a质粒的BL21菌在同等条件下用IPTG诱导为阴性对照。 
    2  结  果 
    2.1  pET-32a-OAZ-mutation测序图  PCR扩增后,DpnⅠ酶切产物并转化大肠杆菌DH5α,挑取阳性克隆,鉴定含有目的基因后,抽提质粒,以T7启动子序列为测序引物序列于ABI3730测序仪进行DNA序列测定,确定OAZ基因的TGCTCCTGATGCC(196~208)处的202位T已缺失,其余序列没有变化(测序图中的第312~323号序列为TGCTCC GATGCC,显示T已缺失)。见图1。 
    2.2  重组pET-32a-OAZ-mutation在BL21宿主菌中的蛋白表达  SDS-PAGE分析结果显示,经IPTG诱导的含重组质粒BL21与对照菌相比,在相对分子质量为45 900位置上出现1条新带。见图2。图1  T7启动子测序结果图 
    图2  表达产物SDS-PAGE图 
    MMarker;1BL21菌;2转化pET-32a质粒的BL21菌;3转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌,经IPTG诱导后2 h;4转化pET-32a-OAZ-mutation质粒的BL21菌,经IPTG诱导后4 h 
    3  讨  论 
    细胞的生命活动需要多聚胺(polyamine)类物质,包括腐胺(putrescine)、亚精胺(spermidine)和精胺(spermine)。多聚胺几乎是所有活细胞的必要组分,它们的缺失将导致细胞生长减少甚至死亡,但是当它们的含量升高时也会有致癌作用并且可以诱导细胞凋亡[6-7]。有研究表明,细胞内OAZ的过度表达除了能降低细胞内多胺水平,还能抑制细胞的生长。而OAZ能够特异地拮抗ODC的催化活性,减少细胞内多胺的生成,因此成为研究抑制肿瘤细胞恶性增殖的切入点[8]。
从最初哺乳类动物细胞中克隆出OAZ基因至今,已陆续发现有OAZ1、OAZ2和精子特异性的OAZ3基因。其中OAZ1,也就是通常所说的OAZ基因,其表达的蛋白产物对于ODC有特异性的拮抗作用。OAZ的的抑制作用不是直接降解ODC,而是OAZ与ODC结合后,通过26S蛋白酶降解ODC,是一种在翻译后水平调节酶活性的机制。ODC是一个二聚体酶,亚基间的聚合与解聚非常迅速。OAZ对于ODC单体蛋白有非常高的亲和力,形成AZ∶ODC的蛋白聚合体,促进ODC被26S蛋白酶降解[7~11]。人OAZ蛋白是由两段ORF的表达框所翻译表达,在第一个表达框的终止密码子处,有一个核糖体移位位点,在精胺诱导下,出现程序性的阅读框的移位。越过终止密码子,继续住下游翻译,直至第2个表达框的终止密码子处。全部蛋白共由228个氨基酸所组成,其中ORF1编码N末端68个氨基酸,ORF2编码C末端160个氨基酸。ORF2编码的C末端氨基酸序列是真正发挥抗酶活性的肽链区段,但是该区段的蛋白表达需要在精胺的诱导下才能出现,因此增加了对于OAZ全长蛋白调控机制的研究难度。 
    故此,本研究通过定点突变技术,成功地使OAZ基因ORF1与ORF2间的核糖体移位位点发生缺失,也就是使ORF1的终止密码子的TCCTGATGCC的T发生缺失,使核糖体按照随后GAT GCC的三联体顺序进行翻译,无需精胺的诱导即可表达出完整的OAZ蛋白。由于选用质粒pET-32a作为原核表达载体,OAZ蛋白表达的同时,还在其C末端携带有多聚组氨酸的标签,可通过His标签蛋白进行纯化,为进一步研究其在肿瘤细胞中的调控机制提供了条件,为开发其临床应用奠定了基础。 
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