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lican8341的博客

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日志

 
 

FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸 的实验研究  

2015-08-28 22:44:21|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】目的:研究FasL反义寡核苷酸对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用。方法:用流式细胞术检测肝癌细胞系HepG2.2.15细胞表面Fas、FasL的表达及Jurkat细胞表面Fas的表达;用HepG2.2.15细胞与Jurkat细胞共培养方法,研究FasL诱导T细胞凋亡的功能;用脂质体介导法转导FasL反义寡核苷酸入肝癌细胞,并通过检测细胞表面FasL表达、RTPCR及细胞共培养方法研究FasL反义寡核苷酸转导对肝癌细胞免疫抑制的逆转作用。结果:①HepG2.2.15细胞低表达Fas,却表达有功能的FasL,与高表达Fas的Jurkat细胞共培养可诱导后者凋亡;②肝癌细胞转入FasL反义寡核苷酸后,FasLmRNA降低;细胞表面FasL表达下降;与Jurkat细胞共培养,Jurkat细胞的凋亡率下降。结论:肝癌细胞表达的FasL可抑制T细胞的免疫功能,是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一;FasL反义寡核苷酸转导可以逆转肝癌细胞的免疫抑制作用。

    【关键词】肝肿瘤?Fas/FasL?免疫逃逸?寡核苷酸类,反义

    The FasL antisense oligonucleotide could reverse the immune escape in hepatocarcinoma cell line

    【ABSTRACT】Objective:To investigate the reverse action of FasL antisense oligonucleotide on the immune escape through Fas/FasL pathway in hepatocarcinoma cells.Methods:Fas、FasL expression of hepatocarcinoma cell line HepG2.2.15 and Fas expression of Jurkat cell were examined by flow cytometry.FasL function of inducing Tlymphocytes to apoptosis was assessed by cocultrue assays in vitro using hepatocarcinoma cells HepG2.2.15 and Jurkat cells.The hepatocarcinoma cells were transfected with FasL antisense oligonucleotide mediated by lipofectin.The reverse action was investigated by the ways of detecting the FasL expression,RTPCR and coculture assays.Results:①HepG2.2.15 cells express Fas at a very low level,but express functional FasL which could induce Jurkat cells with high Fas expression to apoptosis in cocultrue assays,②After the hepatocarcinoma cells were transfected with FasL antisense oligonucleotide,the FasL mRNA,the rate of FasL expression and the apoptotic rate of Jurkat cells in coculture assays all decreased.Conclusion:FasL expressed by the hepatocarcinoma cells could inhibit the immune function of Tlymphocytes.It was one of the important mechanisms of immune escape in hepatocarcinoma cells.FasL antisense oligonucleotide could reverse the action of immune inhibition.

    【KEY WORDS】Liver neoplasms?Fas/FasL?Immune escape?Oligonucleotide,antisense    近年研究发现,某些肿瘤细胞表达FasL,可以与激活的T细胞表面的Fas结合,诱导T细胞凋亡,从而反击宿主免疫系统,逃避免疫监视。本实验对人肝癌细胞株HepG2.2.15细胞FasL的表达及功能进行检测,探讨肝癌细胞通过Fas/FasL途径的免疫逃逸机制,并设计合成特异的FasL反义寡核苷酸(ASODN),封闭肝癌细胞FasL的表达,以期阻止免疫细胞凋亡,逆转肿瘤细胞的免疫逃逸。

    1  材料和方法

    1.1  仪器和试剂  兔抗人Fas、FasL多克隆抗体,为Santa Cruz公司产品。FITC标记的羊抗兔IgG抗体,购自华美生物公司。鼠抗人FasL中和性单克隆抗体NOK2、Annexin VFITC凋亡检测试剂盒及流式细胞仪FACSCan,均为美国BD公司产品。脂质体OligofectamineTMReagent,为美国Invitrogen公司产品。TRIzol Reagent、Reverse Transcriptase、Taq DNA polymerase等RTPCR用试剂,均购自上海生工生物工程技术公司,引物及FasL反义、正义寡核苷酸(SODN),由上海生工生物工程技术公司合成。

    1.2  细胞培养  人肝癌细胞株HepG2.2.15及Jurkat细胞由中国医学科学院提供。HepG2.2.15细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中;Jurkat细胞培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中。37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。

    1.3  流式细胞术(FCM)检测肝癌细胞表面Fas、FasL表达及Jurkat细胞表面Fas表达  收集正常生长的HepG2.2.15细胞及Jurkat细胞,PBS洗两次,分别加入1∶30稀释的兔抗人Fas、FasL抗体,用PBS代替一抗作阴性对照,4℃反应30min;PBS洗一次,加入1∶90稀释的FITC标记的羊抗兔IgG抗体,4℃避光反应30min,PBS洗一次,加入PBS 500μl,上机检测。

    1.4  肝癌细胞FasL功能检测  HepG2.2.15细胞2×106/孔接种至6孔培养板,培养至细胞密度达80%以上时,去除培养液并冲洗板孔。实验组(A组):HepG2.2.15细胞加入Jurkat细胞4×105/孔;NOK2处理组(B组):HepG2.2.15细胞加入10μg/ml的FasL中和抗体NOK2 400μl,孵育1h后加入与A组等量Jurkat细胞;对照1组(C组):Jurkat细胞单独培养;对照2组(D组):Jurkat细胞加入与B组等量NOK2。继续培养24h,收集悬液的Jurkat细胞,加PI及Annexin VFITC染色,FCM检测细胞凋亡。可出现四个细胞群;死亡细胞(Annexin-/PI+)、正常活细胞(Annexin-/PI-)、早期凋亡细胞(Annexin+/PI-)、中晚期凋亡细胞(Annexin+/PI+)。

    1.5  FasL反义寡核苷酸转染肝癌细胞  设计FasL ASODN序列与FasL mRNA的翻译起始密码子互补为:5’GTAATTGAAGGGCTGCTGCAT3’;FasL SODN序列:5’ATGCAGCAGCCCTTCAATTAC3’,均经硫代化修饰。HepG2.2.15细胞1.5×106/孔接种至6孔培养板,培养至细胞密度达30%~50%时,去除培养液并用无血清培养基洗一次,每孔加入无血清DMEM800μl。分别将6,10,14μl浓度为20μmol/L的FasL ASODN/SODN及按4∶1体积比的OligofectamineTM各自用无血清DMEM稀释后,一一对应混匀,各形成FasL ASODN/SODNOligofectamine复合体200μl,室温放置15~20min后,分别加入细胞中,并设未处理对照组。转染液中FasL ASODN/SODN的浓度分别为120,200,280nmol/L,培养4h后,撤出转染液,加入含10%胎牛血清的DMEM培养液,继续培养48h后收集细胞。

    1.5.1  FCM检测ASODN/SODN转染细胞后FasL表达  收集不同剂量各处理组及对照组细胞,FCM检测FasL的表达,方法同前。

    1.5.2  半定量RTPCR法检测ASODN/SODN转染细胞后FasLmRNA水平的变化  收集FasL ASODN/SODN的转染浓度为200nmol/L的处理组及对照组细胞,按TRIzol Rengent操作说明提取总RNA,逆转录合成cDNA,然后PCR扩增,FasL引物为5’GGATTGGGCCTGGGGATGTTTCA3’,和5’TTGTGGCTCAGGGGCAGGTTGTTG3’,扩增片段344bp;βaction引物为5’GTGGGGCGCCCCAGGCACC3’和5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTT3’,扩增片段506bp。循环参数:变性96℃15sec,退火55℃30sec,延伸72℃3min,扩增40个循环。扩增产物点样到1.5%琼脂糖凝胶中,加DNAmarkerDL2000作参照,35V/cm,电泳1h,Gel Dos1000凝胶图像分析仪扫描各条带,用Molecular Analysis软件,以βactin基因作内参照,分析各组FasL mRNA的相对表达量。

    1.5.3  FCM测Jurkat细胞与4组HepG2.2.15细胞共培养后细胞凋亡变化  取FasL ASODN/SODN转染浓度为200nmol/L的处理组及对照组细胞,去除培养液并冲洗板孔。加入Jurkat细胞5×105/孔,继续培养24h后,收集悬浮的Jurkat细胞,加PI及Annexin VFITC染色,FCM检测细胞凋亡。

    1.6  统计学方法  多组均数两两比较采用q检验,两均数比较采用t检验。

 2  结  果

    2.1  肝癌细胞表面Fas、FasL表达及Jurkat细胞表面Fas表达  肝癌细胞系HepG2.2.15细胞表面Fas的表达率为(1.24±0.31)%,FasL的表达率为(18.03±1.03)%,Jurkat细胞表面Fas的表达率为(87.23±1.90)%(见图1)。

   2.2  肝癌细胞FasL功能检测  实验组Jurkat细胞与HepG2.2.15细胞共培养后凋亡率为(21.41±2.11)%,NOK2处理组、对照1组、2组Jurkat细胞凋亡率分别为(8.91±1.00)%、(4.19±1.97)%、(5.67±1.45)%,实验组与NOK2处理组、对照1组、2组均有统计学意义(q=17.483,24.084,22.014,均P<0.01)。对照1组、2组差异无统计学意义(q=2.070,P>0.05)(见图2)。
   
    2.3  肝癌细胞转染FasL ASODN后的变化

    2.3.1  HepG2.2.15细胞FasL表达率  HepG2.2.15细胞经FasL ASODN作用后FasL的表达率下降,FasL ASODN浓度为120,200,280nmol/L的处理组FasL的表达分别为(13.07±1.23)%、(7.94±0.94)%、(5.54±1.17)%,分别与对照组(18.06±1.47)%比较差异均有统计学意义(t=4.509,10.046,11.542,P<0.05,P<0.001),并呈剂量相关性。相应浓度FasL SODN处理组FasL表达分别为(17.57±1.42)%、(16.44±1.57)%、(17.25±1.50)%,与对照组差异无统计学意义(t=0.415,1.305,0.668,均P>0.05)(见图3)。

    2.3.1  HepG2.2.15细胞FasLmRNA水平  HepG2.2.15细胞经FasL ASODN作用后 FasL mRNA水平下降,电泳图像示条带变浅,以βactin基因作内参照,ASODN组 FasL mRNA的相对表达量为0.3433,而对照组及SODN组分别为0.8023、0.8512(见图4)。

    2.3.3  与HepG2.2.15细胞共培养后Jurkat细胞凋亡率  HepG2.2.15细胞经FasL ASODN作用后,与 Jurkat细胞共培养,Jurkat细胞凋亡率下降,为(11.04±1.12)%,与对照组(21.81±1.84)%比较差异有统计学意义(t=8.660,P<0.001)。SODN组Jurkat细胞凋亡率为(21.55±1.90)%,与对照组差异无统计学意义(t=0.170,P>0.05)(见图5)。

    3  讨  论

    Fas和Fasl相互作用是诱导细胞凋亡的重要途径。研究发现,某些肿瘤细胞不仅可以通过Fas/FasL系统抵抗Fas介导的凋亡,并且能反击免疫细胞使T细胞凋亡。文献报道人黑色素瘤、结肠癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤细胞表面均有FasL的表达[1,2,3],FasL与激活的T细胞表面的Fas结合,诱导T细胞发生凋亡,从而反击宿主免疫系统,逃避机体免疫监视[4],导致肿瘤发生和发展。为探讨肝癌细胞通过Fas/FasL途径的免疫逃逸机制,本实验用FCM检测人肝癌细胞系FasL的表达阳性率为18.03%。肿瘤特异抗原能诱导TIL高表达Fas,使T细胞对FasL诱导的凋亡敏感[5]。 Jurkat细胞来源于人T淋巴细胞白血病细胞,与活化的T细胞功能相似,可作为活化的T细胞广泛应用于实验。 Jurkat细胞高表达Fas,本实验Fas表达阳性率为87.23%。HepG2.2.15细胞与 Jurkat细胞共同培养结果显示,HepG2.2.15细胞可诱导 Jurkat细胞发生凋亡,凋亡率为21.41%;用FasL中和抗体NOK2封闭HepG2.2.15细胞表面FasL后,再与 Jurkat细胞共培养, Jurkat细胞凋亡率下降为8.91%;实验组与NOK2处理组、对照组比较均有显著差异;而 Jurkat细胞加入NOK2并不影响其凋亡情况。表明肝癌细胞表面的FasL有诱导淋巴细胞凋亡的作用,从而能抑制机体免疫细胞的功能。肝癌细胞表面Fas表达常常下调或缺失,本实验发现HepG2.2.15细胞Fas表达阳性率仅为1.24%。Fas低表达使肝癌细胞可以免于FasL的攻击,抵抗Fas介导的凋亡。肝癌细胞以及激活的T细胞表达的FasL不能作用于癌细胞,则转而作用于高表达Fas的T细胞,诱导其凋亡。由此可见,肿瘤细胞在与免疫细胞相互作用过程中,能利用Fas/FasL途径反向作用于免疫效应细胞,在自身受到免疫攻击之前诱导免疫细胞凋亡,从而主动逃避机体免疫监视。有研究发现[6],高转移肝癌细胞株FasL表达明显高于低转移株,可见表达FasL的肿瘤细胞由于能抑制淋巴细胞功能,逃避机体免疫细胞的杀伤,使细胞伴有高转移潜能。因此,异常表达FasL,抑制机体免疫功能是肝癌发生和发展的重要机制之一。

    肿瘤细胞表达FasL反击T细胞这一重要的免疫逃逸机制的阐明,为针对Fas/FasL为靶点制定肿瘤的免疫治疗策略提供了新的思路和理论根据。阻断FasL介导的肿瘤细胞对免疫细胞的杀伤作用,则有望逆转肿瘤细胞的免疫逃逸[7]。其中,封闭肿瘤细胞的FasL表达是重要途径之一。反义基因技术是近年来发展起来的一种新技术,通过合成针对某种基因的反义寡核苷酸,经脂质体包裹等方法导入细胞后,能以多种作用方式影响目的基因的转录,阻止mRNA的翻译,起“基因封条”的作用。反义基因特异性强,细胞毒性小,具有良好的临床应用前景,目前已广泛受到关注,但国内尚未见将FasL反义寡核苷酸转导入肿瘤细胞的报道。本实验设计合成特异的FasL反义寡核苷酸,转导入表达FasL的肝癌细胞,有效地使细胞内FasLmRNA降低,细胞表面FasL表达下降,Jurkat细胞与之共培养后的凋亡率下降。从基因蛋白细胞效应三方面观察到FasL反义基因能有效地封闭肝癌细胞表面FasL表达,使肝癌细胞诱导T细胞凋亡的能力减弱,阻断肿瘤细胞对免疫细胞的杀伤,逆转其免疫抑制作用,为肝癌的反义基因治疗提供了理论根据。

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