注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

毛细管区带电泳中场增强进样柱内富集的非线性特征  

2015-08-28 21:57:51|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

【摘要】  直接柱头场效应进样是一种毛细管区带电泳柱内富集,其进样过程中样品在柱内的分布可分为两部分,即在运行缓冲溶液中的堆积区段和由电渗流引入的样品溶液区段。通过对溶质输运行为的研究表明:两区段长度与进样时间之间并非简单的线性关系,因此进样量与进样时间的关系也非线性,且与溶质淌度有关;进样量的增加并不能导致富集倍数的同步增加,由于层流的作用使得场效应进样柱内富集效果降低。为了在保持柱效基本不变情况下得到好的富集效果,除需使溶质在运行缓冲溶液和样品溶液中的电导率比极大外,进样时间也应与之匹配。

【关键词】  毛细管电泳,富集,进样

  Abstract  FASS(field amplified sample stacking) is a technique for oncolumn enrichment in capillary zone electrophoresis. The distribution of solute in column during injection can be divided into two parts: the stack zone in running buffer and the sample solution zone imported by electroosmosis. Based on the investigation of transfer of solute in column, the results showed that the relationship between the length of two zone and injection time was nonlinear, so the relationship of injecting size that related with the mobility of solute and injection time. The increasing of the enrichment effect will not synchronize with the increasing of injection size, and the enrichment effect is decreased due to the laminar flow. To hold a basic constant column efficiency and desire enrichment effect, the ratio of mobility of solute in two zones should be maximum, and the 
  
  Keywords  Capillary zone electrophoresis, enrichment, sample injection

  1 引 言

    毛细管电泳柱上浓缩可分为电堆积富集和场增强进样两种技术,电堆积富集在流体动力进样后实现,这种方法将样品溶解在稀释的载体电解质溶液中,因为样品溶液的电阻率大于载体电解质溶液,导致流体动力学进样后,在外加电压下分配在样品区带中的电场强度高于充满载体电解质溶液的毛细管柱其它部分,样品离子在高电场作用下迁移速度较快;当样品离子迁移到初始样品区段与运行区段的边沿时,由于电场强度的降低,迁移速度将会相对变慢,样品离子在边沿处堆积,并得到富集。场增强进样作为毛细管电泳柱上浓缩技术的基本原理与电堆积富集相同,但这种技术在电动进样过程中实现[1,2]。样品溶解在载体电解质浓度很低的溶液中,电动进样时进样口端的电场强度远高于毛细管内部,样品离子在高电场强度下有较快的迁移速度,样品负离子的迁移速度方向与电渗流方向相反一般不能进入毛细管中,而正离子的迁移方向与电渗流方向相同,可进入到毛细管中,并在较低的电场强度下迁移速度迅速下降,如此达到样品正离子的柱上浓缩。

    Chien等[3]认为样品正离子在毛细管进样口端的富集,可能会导致局部离子强度的很大提高而影响进样口端的局部电场强度,使电堆积效率降低,并采用在柱头先引入一小段水柱来解决。实际上,在柱头引入水柱同样也可能对浓缩过程产生损失,而且必须以动力进样的方式压入水柱,操作很不方便。由于载体电解质浓度一般较高,样品在柱头的堆积伴随着载体电解质中同离子的同时迁移,该结果使得柱头边沿上的离子强度不可能有太大的变化。

    在场增强进样的过程中,柱内的场强变化及进样量等均随进样时间而变化。Chien等[4]研究了场增强进样时进样量的求算方法,Dose[5]和曹军等[6]也通过计算机模拟的方法对进样量作过研究。Osbourn等[7]对毛细管电泳中的不同样品富集技术的原理做了系统综述,本文作者在毛细管电泳在线富集方面也做了理论与应用的研究 [8~10],尤其在电色谱中,甚至做到超长进样进行样品的富集[10]。本研究进一步探讨直接柱头进样情况下多种因素的综合作用及样品在柱内富集过程的非线性特征。

  2 理论部分

    直接场效应进样的方法采用低离子强度的缓冲溶液配制样品,柱管内预先充满高离子强度的缓冲溶液,在一定的场强作用下进样。样品的带电性质不同,在电场的作用下其输运规律也不相同。本研究只考虑碱性样品的柱内富集过程。碱性样品阳离子的进样过程不仅受到电泳迁移的作用,同时电渗流的作用也占有重要地位,样品的场效应进样过程可以采用图1的简单模型加以说明。  图1  碱性样品场效应进样过程
Fig.1  Field amplified sample stacking(FASS) injection procedure of alkaline sample配制样品采用的缓冲溶液的浓度为C1,而预先充满柱管的缓冲溶液的浓度为   C2。场效应进样时,由于两种溶液的离子强度不同,在两区段中的电场强度也将不同。样品溶液进入到毛细管中形成进样区段,根据文献[3],可确定其局部场强与总场强的关系。

    由于层流的作用,使得只能有一部分样品以层流的速度进入到毛细管中。Chien等[2]的研究表明,在C1区段中这种层流的作用以电渗流为参照系时,是一个负作用,而在C2区段中为正作用。考虑到液体的不可压缩性,柱管中总的电渗流速率即层流速度应等于两区段中电渗流速率的平均值。ueo=γxueo1+(1-x)ueo2γx+(1-x)(1)其中,ueo1, ueo2分别为单独以缓冲溶液1和缓冲溶液2进行电泳过程时的电渗流速率; x为进样段样品区带占总毛细管长度的比例,与进样时间有关;γ为两区带的电导率比,可近似认为γ=C1/C2,当以水配制样品时,必须考虑样品离子对总电导率的贡献,否则一般可以不考虑样品离子的影响。
        
  设定进样时间为tinj, 进样长度为linj,那么进样长度与进样时间的关系为:tinj=∫linj01/eodx(2)其中, eo为平均电渗流速度,与x有关。

    结合式(1)和(2)可得tinj=(γ-1)linjγueo1-ueo2+γ(ueo1-ueo2)l(γueo1-γueo)2·ln(γueo1-ueo2)linj+ueowlueo2l(3)式(3)说明场效应进样的进样长度与进样时间之间并非简单的线性关系。碱性样品中的阳离子在电场中的迁移方向与电渗流方向相同,因此富集区段的长度为:ls=∫linj0(uep2+ueo2)E2dt(4)其中,uep2为样品离子在运行缓冲溶液中的电泳速度。再结合式(2)、(4)也可以得到:tinj=(γ-1)lsγueo1-ueo2+γ(ueo1-ueo2)l-(1-γ)uep2(γueo1-ueo2)2ln1+(γueo1-ueo2)lsuep2l(5)样品进入柱管的量等于在柱管入口处样品浓度与其速度和柱管截面积的乘积m=SC(0)in(6)其中,S为柱管截面积;uin为样品在柱头处的平均速度;样品在柱头的速度uin=uep1+ueo,因此m=SC(0)∫linj0(uep1)+ueodt(7)注意到linj =∫linj0E0ueodt,而由E1和E0的关系,可以将进样量表示成Iinj的函数形式:m=SC(0)linj+uep1(γ-1)linjueo2-ueo1-γueo1-ueo2ueo2-ueo1uep1tinj(8)式(8)描述了进样时间与进样量之间的关系,对比式(7)与式(8)进一步得到lx区段中所进入的样品量为:mx=SC(0)uep1(γ-1)linjueo2-ueo1-γueo1-ueo2ueo2-ueo1uep1tinj(9)运行状态下,在linj区段的样品经“扫”的过程[11]也将大部分被富集到lx区段。如果认为这一过程可以瞬时完成,则总的富集倍数为:η=(ueo2-ueo1)linj+uep1(γ-1)linj-(γueo1-ueo2)uep1tinj(ueo2-ueo1)lx(10)式(10)说明富集倍数η与γ之间的关系并非简单的正比例关系,由于层流的作用以及进样过程中离子迁移速度随时间的变化使得结果复杂化,可以采用式(10)进一步讨论进样时间等因素对富集效果的影响。

  3 实验部分

    Beckman MDQ毛细管电泳仪,紫外检测器,检测波长214 nm。毛细管柱(60 cm×50 μm,河北永年锐沣色谱器件有限公司),从柱头到检测器窗口49.5 cm。运行电压25 kV,柱温25 ℃。

    吡啶、2二甲基氨基吡啶、乙酸、NaOH等试剂均为分析纯(上海试剂公司)。运行缓冲液含乙酸50 mmol/L,NaOH调节pH=4.9。样品:1#含乙酸50 mmol/L; 2#含乙酸10 mmol/L; 3#含乙酸5 mmol/L; 4#含乙酸1 mmol/L; 5#不含乙酸。配制的样品电解质浓度均为吡啶0.5 mmol/L、2二甲基氨基吡啶0.4 mmol/L。

  4  结果和讨论

  4.1  进样时间与进样区段长度的关系

    采用压力进样的方法测定样品在不同浓度缓冲溶液条件下的电渗流速度。进样压力3.45 kPa,进样时间5 s。根据得到的电渗流数据及其它实验条件,通过式(3)和式(5)计算区段linj和ls与进样时间的关系,结果见图2和图3。从图中可以看出,随着进样时间的延长,两区段的长度也随之增长,但进样时间与两区段长度之间的关系皆非简单的线性关系。由于对两区段的真实长度不能够找到合适的方法进行测量,因此图中的结果可以从理论上对其变化趋势给出定性的说明。

  4.2 进样操作电压与进样量的关系

    随着进样电压的增加,样品离子的电泳速度和缓冲液的总体电渗流速度都相应加快,在相同的时间内,进入到毛细管中的样品量也随之增加。图4给出了实验得到的进样操作电压与检测峰面积的关系,线形回归相关系数皆大于0.99。由式(8)可知,进样电压与进样量之间应为近似线性关系,样品的淌度越大,直线的斜率越大,即在相同的进样时间内进入毛细管的样品量越多。从图4可以看到, 2二甲基氨基吡啶的进样电压与进样量关系直线的斜率大于吡啶,这是因为前者的电泳淌度大于后者之故。

  4.3 进样时间与峰面积的关系

    在正常电泳输运情况下,进入毛细管的样品量与峰面积成正比,可以通过控制进样时间来控制进样量,这也是电泳方法进行分析定量的基础。由上面的讨论可知,在场增强进样的情况下,进样时间与进样量之间的关系较为复杂,单纯地以进样时间来说明进样量在有些条件下可能会产生很大的误差。图5为以2二甲基氨基吡啶为样品得到的进样时间与峰面积之间关系的实验结果。

  进样量由层流进样部分和进样富集部分组成。两部分中的样品量均与进样时间有关,且这种关系非简单的线性关系。图5给出了采用式(8)得到的理论拟合结果,理论与实验结果在趋势上符合较好。

    由于场增强进样的进样时间与进样量之间的非线性关系,给样品的定量研究带来诸多不便。定量工作曲线的绘制,必须与样品的分析条件一致,而且为非线性的形式。以式(8)替代一般的工作曲线进行定量校正,更为方便,但对条件的选择也应与实际分析条件尽量保持一致。
  图4  进样电压对进样量的影响

  4.4 富集倍数与进样时间的关系

    柱内富集的指标为富集倍数,在以紫外检测器进样检测时,尽管峰面积的富集倍数可能很大,但浓度的富集倍数十分有限(见图6和图7)。直接进样场增强柱内富集的过程可以分成两步:首先是进样过程中的富集,这一步富集在整个富集过程中占有主要地位。样品被富集到ls区段中,这与在柱头引入水柱的情况完全一致;再者进样完成后,区段linj中的样品进一步完成第二步富集,其原理与第一步相同。经过两步富集过程样品最后全部集中在比ls稍大的范围内。进样时间加长,进样量加大,但同时样品区带的宽度也会加大,使峰高降低,即进样时间对峰高富集倍数及峰面积富集倍数的影响并非同步。同时,由式(8)可知,层流作用也会使富集倍数下降。图6和图7给出了一组理论和实验结果。

  电泳柱内富集的基础即配制样品缓冲液与运行缓冲液浓度的不同,理论上讲,富集倍数与两种缓冲液的浓度比成正比,也就是说通过场增强进样对样品进行柱内富集可以达到相当高的富集倍数,而实际上实验可以达到的富集倍数最多只有数百倍。实际富集效果与理论结果直接的差别可以从式(9)中看出,两种缓冲溶液的浓度相差越大,可能导致的层流影响越大,对特定的样品,根据进样时间与富集倍数之间的关系,可以找出最佳进样时间,以保证适当的富集倍数与峰展宽。此外加大进样时间也会使毛细管的剩余部分相对变短,柱效降低,影响分离。

  5 结 论
    
  从理论上研究了毛细管区带直接电泳场增强进样柱内富集过程中各种因素对富集效果的综合影响,得到了进样区段长度与进样时间以及进样量与进样时间的关系,并通过实验加以验证。结果表明,进样电压对进样量的影响与样品的电泳淌度有关,电泳淌度越大,进样电压与进样量关系直线的斜率越大。进样时间与进样量之间并非简单的线性关系,这一结果导致场增强进样非线性的定量工作曲线。进样量的富集倍数与浓度的富集倍数的增加并非同步,相对而言,对浓度的富集倍数稍低一些,这与进样过程中的层流作用等有关。为了得到好的富集效果及高的柱效,必须选择合理的进样时间及两种缓冲溶液的浓度比。

  评论这张
 
阅读(68)| 评论(0)
推荐 转载

历史上的今天

在LOFTER的更多文章

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2017