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lican8341的博客

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日志

 
 

嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞的作用  

2015-09-19 19:49:41|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 研究体外培养的大鼠嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell,OEC)对活化的星形胶质细胞(astrocytes,AST)的作用。方法: 体外培养嗅鞘细胞和星形胶质细胞。星形胶质细胞经纯化传代,细胞融合后利用划伤法得到活化的星形胶质细胞,将嗅鞘细胞与活化的星形胶质细胞共培养24 h后,观察星形胶质细胞增殖能力的改变,以及其表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)的变化。结果: 活化的星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养后,MTT实验表明其增殖能力增强;免疫荧光染色、RT-PCR和蛋白质印迹法测定结果表明共培养后活化的星形胶质细胞表达的GFAP和CSPG降低。结论: 嗅鞘细胞作用于活化后的星形胶质细胞以后,能够促进星形胶质细胞的分裂增殖,同时能够减少星形胶质细胞胶质化,降低抑制性细胞因子的表达。

【关键词】  嗅鞘细胞; 星形胶质细胞; 增殖; 胶质纤维酸性蛋白(GFAP); 硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)

  [Abstract] Objective: To study the effect of olfactory ensheathing cells on reactive astrocytes in vitro.Methods: Olfactory ensheathing cells and astrocytes were cultured from Sprague Dawley Rats in vitro. Astrocytes were purified then passaged and grown to confluence.Some cultures were scratched to induce a reactive astrocyte phenotype.Olfactory ensheathing cells were added onto confluent astrocytes for 24 h.The differences of cell proliferation,expressions of glial fibillary acidic protein(GFAP) and chondroitin sulfate proteoglycans(CSPG) were measured among the normal group, active group,and the cocultured group. Results: When olfactory ensheathing cells were cocultured with reactive astrocytes,the proliferation of reactive astrocytes was increased, and a decrease in GFAP and CSPG expression was also observed. Conclusion: After cocultured with reactive astrocytes, olfactory ensheathing cells can promote the proliferation of reactive astrocytes,and reduce the astrocyte gliosis and expression of inhibitory cytokines.

  [Key words] olfactory ensheathing cells; astrocytes; proliferation; GFAP; CSPG

  脊髓损伤的治疗是临床的一大难题,缺乏有效的治疗方法,因此一直是科研人员和临床工作者关注的重点。嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cell,OEC)本身具有促进神经细胞和嗅神经再生的重要功能,而且能够分泌多种神经营养因子和促进神经再生修复的黏附分子[1]。脊髓损伤后嗅鞘细胞移植有利于轴突的再生,减少组织的丢失,促进运动功能的恢复[2-3]。

  脊髓损伤后由星形胶质细胞(astrocytes,AST)等过度增生的胶质瘢痕是影响轴突再生和功能恢复的主要不利因素。嗅鞘细胞容易与星形胶质细胞混合生长,不会引起后者的肥大以及硫酸软骨素蛋白多糖(CSPG)表达的增加。不仅如此,嗅鞘细胞移植到损伤的脊髓背根后,传入纤维的轴突能够穿越损伤区域的胶质瘢痕到达脊髓,轴突与神经元再次建立功能联系[4]。Li等[5]认为嗅鞘细胞的修复作用尤其是促轴突再生,形成新的传导通路等方面与星形胶质细胞密切相关。

  嗅鞘细胞是否作用于损伤早期活化的星形胶质细胞,从而减少其增生,减轻胶质瘢痕的形成还不是很清楚。本实验采用体外细胞共培养的方法,排除脊髓损伤后复杂的细胞环境等其他因素干扰,探讨嗅鞘细胞对活化的星形胶质细胞增殖能力、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和CSPG表达的影响以及可能机制。

  1 材料和方法

  1.1 材 料

  DMEMF12(1∶1)、FBS、0.25%胰蛋白酶+0.05%EDTA(Gibco公司,美国);PolyLlysine(Sigma公司,美国);兔抗NGFRp75、小鼠抗人 GFAP、FITC羊抗兔IgG、FITC羊抗小鼠IgG(购于博士德公司);Hoechst 33342 染色液(购于碧云天);CSPG单克隆抗体,FITC IgG二抗(Sigma公司,美国);MTT细胞增殖检测试剂盒;插入式培养皿(Millipore公司,美国)。清洁级SD大鼠,1~7 d龄,购于江苏大学动物中心。

  1.2 方 法

  1.2.1 嗅鞘细胞的分离和培养 取<1周的SD大鼠,显露并完整取下嗅球,剪碎组织,0.25%胰酶消化10 min,含10%FBS的DMEM终止消化,20%FBS的DF12制作细胞悬液。差速贴壁后转入PLL包被的培养瓶中,2 d左右OEC细胞贴壁,继续培养至细胞大部分融合。NGFRp75免疫荧光染色测定细胞纯度>80%。

  1.2.2 星形胶质细胞的分离和培养 新生1~3 d的SD大鼠,取大脑皮质并剥除外膜,0.25%胰酶加0.05%EDTA消化,20%FBS的DF12培养基制成细胞悬液,调节细胞密度为1×106,接种于6孔板差速贴壁处理1 h左右,转入新的6孔板中继续培养,3 d后半量换液,继续培养至细胞融合达到90%左右。

  将培养板在37 ℃恒温摇床中以180 r/min振荡18 h后,消化传代,转入包被PLL的24孔板中继续培养,一般3~5 d后即融合。

  1.2.3 星形胶质细胞的活化 星形胶质细胞融合后,利用枪头制造机械损伤,无血清完全培养基继续培养24 h后即得到活化的星形胶质细胞。

  1.2.4 星形胶质细胞与嗅鞘细胞共培养 嗅鞘细胞大部分融合后,消化,用无血清的DMEM制成1×105/ml密度的细胞悬液。嗅鞘细胞培养上清液通过嗅鞘细胞融合后加入无血清的DMEM培养24 h获得。

  传代星形胶质细胞活化结束以后,将星形胶质细胞分成4组,分别为:正常组、活化组、与嗅鞘细胞共培养组(又分直接共培养组和间接共培养组)。其中正常组和活化组加入无血清DMEM,直接共培养组加入等量的嗅鞘细胞悬液,间接共培养组分为两种方式:24孔板利用孔径0.4 μm的插入式培养皿实现;96孔板使用嗅鞘细胞培养上清液(用于MTT实验)。将上述的细胞继续培养24 h后进行后续试验。

  1.2.5 MTT法检测星形胶质细胞增殖能力 共培养结束后,于96孔板中4个不同组别每孔加入10 μl的MTT溶液,在细胞培养箱中继续孵育4 h;每孔加入100 μl的Formanzan溶解液继续孵育至深紫色结晶Formanzan全部溶解;570 nm测定光密度值。

  1.2.6 免疫细胞荧光法检测细胞形态,数量和GFAP、CSPG的表达 共培养24 h以后,24孔板PBS清洗;4%多聚甲醛固定; 0.5% Triton X100孵育2次; 3%H2O2处理;含5%山羊血清的PBS溶液中孵育;然后加入小鼠抗大鼠GFAP(1∶100)和小鼠抗大鼠CSPG(1∶200)后室温孵育1 h;将标本加入荧光FITC羊抗小鼠IgG(1∶50),室温暗处孵育1 h后,Olympus 荧光显微镜IX71观察拍照。

  对于GFAP和CSPG以及不同的细胞培养组,分别选取源自不同批次试验的不同培养孔的多个视野的图像进行分析。将图像转换成灰度值,活化组的平均灰度值作为100标准值,通过计算不同组别图像的平均灰度值和强度值来半定量分析GFAP和CSPG表达的异同。

  1.2.7 RTPCR法检测星形胶质细胞GFAP mRNA表达 收集24孔板中的细胞,采用Trizol(Invitrogen)一步法进行总RNA提取。紫外分光光度计测定RNA浓度和纯度,D(260 nm)/D(280 nm)在1.8~2.0之间,利用MMLV第一链cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA,进一步进行PCR扩增。引物由上海生工公司合成。β肌动蛋白及GFAP扩增产物大小分别为250 bp和384 bp。PCR反应条件,β肌动蛋白:预变性94 ℃ 5 min,变性94 ℃ 30 s,退火 55 ℃ 30 s,延伸 72 ℃ 20s,30个循环后72 ℃延伸5 min。GFAP:预变性94 ℃ 5 min,变性94 ℃ 1 min,退火 55 ℃ 55 s,延伸 72 ℃ 30 s,30个循环后72 ℃延伸5 min。取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,利用凝胶成像系统对电泳带进行密度扫描,以GFAP/β肌动蛋白比值代表GFAP的相对表达量。各组实验至少重复3次。

  1.2.8 蛋白质印迹法检测星形胶质细胞GFAP蛋白的表达 收集24孔板中的各组细胞,并提取细胞总蛋白。BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。取总蛋白各50 μg进行SDSPAGE凝胶电泳后,转移到硝酸纤维素膜上,封闭后分别加入GFAP、CSPG和β肌动蛋白抗体(工作浓度1∶1 000),4 ℃杂交过夜,洗膜以后加入对应2抗(工作浓度1∶3),室温孵育1 h后BeyoECL Plus显色,于暗室内压片,显影定影。

  1.3 统计学方法

  利用Excel 2003和SPSS13.0软件进行统计学分析,结果以均数±标准差(±s)表示。组间比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

  2 结 果

  2.1 嗅鞘细胞和星形胶质细胞鉴定结果

  经过差速贴壁处理的OEC细胞,细胞纯度>80%;星形胶质细胞经过差速贴壁处理和恒温摇床处理以后,细胞纯度高达90%左右。见图1。

  2.2 共培养前后活化的星形胶质细胞的增殖能力

  与嗅鞘细胞共培养以后,星形胶质细胞的增殖能力增加,与活化组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。不同共培养方式的作用也存在差异,直接共培养组的作用更明显,差异具有统计学意义(P<0.01)。见图2。

2.3 各组星形胶质细胞形态以及GFAP、CSPG蛋白的表达

  在形态上各组的星形胶质细胞无明显区别,见图3 (A,C,E,G)。与正常组(图3 A,B)相比,活化后的星形胶质细胞(图3 C,D)表达更多的GFAP和CSPG。与嗅鞘细胞共培养以后,无论是直接还是间接方式,活化的星形胶质细胞表达GFAP(图3 E,G)和CSPG(图3 F,H)量减少。

  检测结果表明,活化组的GFAP和CSPG的平均荧光强度明显高于正常组,差异有统计学意义(P<0.01)。共培养组GFAP和CSPG的平均荧光强度比活化组降低,尤其GFAP的下降更加明显,差异有统计学意义(P<0.01)。直接和间接共培养组之间有差异,但不具有统计学意义。见表1。表1 半定量分析不同组别星形胶质细胞GFAP和CSPG荧光强度与正常组比较,a:P<0.01;与活化组比较,b:P<0.01

  2.4 与嗅鞘细胞共培养后星形胶质细胞GFAP mRNA的表达

  提取各组星形胶质细胞的总RNA,以此为模板进行RTPCR,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在250 bp处扩增出β肌动蛋白条带,在384 bp的位置上出现特异性的GFAP条带。见图4。通过光密度扫描半定量分析,活化组GFAP mRNA表达量的灰度比值(1.86±0.19),显著高于正常组(1.28±0.22),P<0.01。与活化组相比,直接共培养组(1.46±0.15)和间接共培养组(1.34±0.14)的GFAP mRNA表达减少,P<0.05,差异有统计学意义。其中直接和间接共培养组之间无统计学意义(P>0.05)。

  2.5 共培养后活化的星形胶质细胞GFAP蛋白的表达

  各组别的星形胶质细胞经电泳转膜,分别加入β肌动蛋白和GFAP抗体杂交,曝光后可在42 ku和51 ku出现各自的特异性条带。可见活化组的条带的光密度较正常组高,而共培养组的光密度低于活化组。见图5。

  3 讨 论

  脊髓损伤后,损伤区域形成的胶质瘢痕是阻碍脊髓修复的最主要因素。本研究从形成胶质瘢痕最主要的星形胶质细胞入手,研究嗅鞘细胞对于早期活化的星形胶质细胞的作用,从而探讨嗅鞘细胞在脊髓损伤修复中的作用机制。

  嗅鞘细胞移植进入受损的中枢神经系统以后会对星形胶质细胞产生影响[6];Verdú等[7]发现嗅鞘细胞移植能够影响脊髓损伤后星形胶质细胞的表型,使肥大的细胞减少,增生减轻。以上研究证明两种细胞间作用确实存在。

  脊髓损伤发生后,星形胶质细胞的分裂增殖能够缓解由损伤区域细胞坏死导致的空洞的形成[8]。在胶质瘢痕形成初期,活化的星形胶质细胞能够限制炎症细胞向正常的神经组织扩散[9],而且分泌S100β、FGF2等神经营养因子[10],维持神经元存活、促进神经元再生。本实验证实嗅鞘细胞能够促进活化的星形胶质细胞增殖,从而进一步放大活化的星形胶质细胞在脊髓修复过程中的积极作用。

  GFAP是星形胶质细胞的主要骨架蛋白之一,是中枢神经系统损伤后细胞胶质化反应的主要标志物。星形胶质细胞GFAP的表达在脊髓损伤后逐渐升高,5~7天达到高峰,3~8周胶质瘢痕形成[11]。本实验结果表明,嗅鞘细胞能够下调活化的星形胶质细胞GFAP的表达,说明嗅鞘细胞能够作用于活化的星形胶质细胞,减少或者减缓后者的胶质化过程,从而可能进一步减少胶质瘢痕的形成。

  CSPG是一种神经生长抑制性细胞因子,被认为是中枢神经系统损伤发生后神经元轴突生长失败的主要因素之一[12]。脊髓损伤发生后,在损伤区域表达上调的CSPG能够限制神经元可塑性,最终导致神经元轴突再生失败。利用chABC酶特异性地去除损伤处的CSPG,不仅可促进损伤区域皮质脊髓神经元的再生和萌芽,而且能加强损伤区域周围的正常轴突的分枝[13]。本实验结果显示,嗅鞘细胞使活化的星形胶质细胞CSPG表达下降。可以推测,嗅鞘细胞能够通过这一途径改善星形胶质细胞表达的抑制性细胞因子对损伤修复带来的负面影响。

  本实验结果还显示嗅鞘细胞的这种调节能力在直接共培养组和间接共培养组同样存在,说明嗅鞘细胞分泌的可溶性细胞因子发挥了重要作用。嗅鞘细胞能够分泌神经营养因子(NGF)、胶质源性神经营养因子(BNDF)[14]以及包括白介素1(IL1)、层粘连蛋白(laminin)等黏附分子,可以推测这些细胞因子可能会作用于星形胶质细胞并引起实验中发现的变化。

  嗅鞘细胞通过何种细胞因子以何种方式作用于星形胶质细胞仍然需要进一步的研究来证实。至少本研究证明了嗅鞘细胞对于受损后的星形胶质细胞的瘢痕化有抑制作用,并且能够减少星形胶质细胞分泌抑制性细胞因子。进一步研究其他的细胞对于活化后的星形胶质细胞表型的影响,以及嗅鞘细胞与这些细胞的相互作用有积极意义。星形胶质细胞瘢痕化是中枢神经系统损伤最显著的标志。能够识别这个过程中细胞间的相互作用以及可能的信号传导机制必将为促进修复治疗手段的发展提供新的线索。

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