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日志

 
 

人外周血活化淋巴细胞中Survivin蛋白表达的分子机制研究  

2015-09-19 20:15:28|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】    目的: 探讨活化淋巴细胞中Survivin蛋白诱导表达的信号转导通路、 分子级联反应和生物效应, 揭示Survivin蛋白表达调控的分子机制。方法: 用PHA和rhIL2刺激培养人外周血单个核细胞, 附加JAK抑制剂—AG490的处理, 以Western blot检测Survivin和相关蛋白的表达; 以流式细胞术(FCM)分析细胞周期和细胞分裂增殖。结果: 刺激培养的细胞按照时序先后出现的分子和细胞学反应为: Stat3和Stat5磷酸化→CyclinD3、 CyclinE蛋白水平上调→细胞进入S期及Survivin蛋白起始表达→细胞有丝分裂及Survivin蛋白表达水平增加。AG490对于上述反应均呈现明显的抑制作用, 但对周期抑制蛋白P21和抗凋亡蛋白Bcl2的表达水平没有影响。结论: Survivin蛋白的表达依赖JAKStat信号转导通路的早期活化, 通过上调CyclinD3和CyclinE周期蛋白水平, 启动细胞周期的运行, 诱导Survivin蛋白的周期时相依赖性表达, 参与细胞有丝分裂与增殖。

【关键词】  Survivin蛋白 活化淋巴细胞 信号转导 细胞增殖

  [Abstract]  AIM: investigate the molecular mechanism of regulating survivin expression and related signal transduction pathway, molecular cascade reaction and biological effects in activated PBMC. METHODS: The expression of survivin and related proteins were detected by Western blot in PBMC stimulated by PHA and rhIL2 with or without JAK inhibitorAG490 treatment, and FCM was performed to analyze cell cycle and cell division. RESULTS: Our results indicated that molecular and cellular reactions in PBMC activated by PHA and rhIL2 were dependent on time series. At first, the phosphorylation of Stat3 and Stat5 were observed, then, protein levels of CyclinD3 and CyclinE increased, and the stimulated PBMC began to enter to S phage with survivin protein expression was initiated, which at last resulted in cell division with dramatically increasing expression of survivin protein. AG490 could significantly inhibit all these reactions but had no effect on the expressions of the cell cycle inhibitorP21 and antiapoptosis proteinBcl2. CONCLUSION: The expression of survivin in stimulated PBMC was dependent on the primarily activated JAKSTAT pathway, which upregulated CyclinD3 and CyclinE protein levels, initiated the cell cycle progression, and induced cell cycledependent survivin expression, and so survivin was involved in cell division and cell proliferation.

  [Keywords]survivin; activated lymphocyte; signal transduction; cell proliferation

  存活素(Survivin)是20世纪90年代末期被发现的凋亡抑制蛋白家族成员, 因其具有多样的重要生物学功能和特殊的组织表达谱,  迅速引起生物医学研究领域的热切关注[1]。前期的研究工作已证明Survivin蛋白同时兼有抑制细胞凋亡和促进细胞增殖的双重功能,   并因其在近乎所有的肿瘤组织中特异性表达, 已成为近年肿瘤临床诊断的新的分子标志物及肿瘤治疗研究的热点靶分子[2, 3]。2001年Fukuda等[4]报道, 正常人骨髓和脐血来源、 具有增殖能力的CD34+细胞表达Survivin蛋白, 并受多种细胞因子的刺激诱导其表达上调。我们前期的研究工作[5]也证明, 人外周血中经植物血凝素(PHA)和重组人白细胞介素2(rhIL2)刺激活化的单个核细胞(PBMC), 出现Survivin基因的转录激活和蛋白表达, 并发现JAK(janus protein tyrosine kinase)抑制剂AG490可以完全抑制Survivin蛋白的表达, 表明JAK活性为Survivin蛋白表达所必需。JAK属细胞内非受体型酪氨酸蛋白激酶家族, 通常被细胞因子与受体的结合所激活, 通过对底物分子—信号转导和转录激活子(Stats)的磷酸化反应转导细胞因子的生长信号。JAK抑制剂—AG490是一种人工合成的具有类似酪氨酸结构的小分子化合物, 能与JAK竞争结合而抑制其对内源底物的磷酸化反应。我们先前的研究工作提示, JAKStat信号通路很可能是刺激培养淋巴细胞表达Survivin蛋白的关键信号转导通路, 但信号转导的分子级联反应以及生物效应尚不完全明确, 本研究拟进一步揭示Survivin蛋白在活化淋巴细胞中表达的分子机制。

  1  材料和方法

  1.1  材料  PBMC来自健康献血者全血粗分离的白细胞组分, 由全军采供血中心提供; PHAP购自Sigma公司; AG490购自Calbiochem公司; 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)购自Fluka公司; rhIL2为北京四环生物工程制品厂产品; Survivin、 Bcl2、 pStat3(Tyr705)、 Stat5、 Actin抗体购自Santa Cruz公司; P21、 pStat5(Tyr694)抗体产自日本医学生物研究所(MBL), Stat3抗体购自武汉博士德生物技术有限公司; BCA蛋白定量试剂盒购自Pierce公司; 化学发光底物购自北京天根生化科技有限公司。

  1.2  方法

  1.2.1  PBMC的体外刺激培养  经淋巴细胞分离液分离的PBMC, 以2×109/L细胞密度悬浮于含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液, 加入5 mg/L PHA和5×105 U/L rhIL2, 需要观察抑制剂作用的样本, 同时加入终浓度100  μmol/L的AG490, 细胞在50 mL/L CO2、 饱和湿度、 37℃恒温条件下进行培养, 分别于刺激培养12、 24、 36、 48和64 h收集和处理细胞样本。

  1.2.2  Western blot检测  PBS缓冲液洗涤收集培养的细胞2次, 用含混合蛋白酶抑制剂的裂解液(50 mmol/L TrisHCl pH8.0、 150mmol/L NaCl、 200mg/L NaN3、 1g/L SDS、 10mL/L NP40、 5 g/L去氧胆酸钠)于冰浴中裂解细胞30 min, 超声15 S剪切DNA, 4℃、 12000 r/min离心10 min, 取上清液用BCA法进行蛋白定量。按照每条泳道约50 μg蛋白质上样, 进行120 g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳, 将电泳后的凝胶对NC膜电转移, 再按照常规程序对膜进行抗原抗体结合反应, 化学发光底物法显带。

  1.2.3  细胞周期测定  用PBS缓冲液洗涤收集培养的细胞2次, 重悬细胞于0.3 mL含100 mL/L新生牛血清的PBS缓冲液中, 加入0.7 mL无水乙醇, -20℃固定过夜, 细胞用PBS缓冲液洗2次, 加入0.5 mL含50 mg/L碘化丙啶和50 mg/L RNase A溶液, 37℃水浴保温30 min, 流式细胞术(FCM)分析DNA含量。

  1.2.4  淋巴细胞分裂增殖实验  CFSE是一种活细胞荧光染料, 可自由穿透细胞膜并经细胞内脂酶作用后, 自发不可逆结合于蛋白质的赖氨酸侧链上, 当细胞分裂时, CFSE标记物可平均分配到2个子代细胞中, 因此可以利用荧光强度系列减半的特征, 通过FCM分析CFSE标记淋巴细胞的分裂增殖[6]。将分离后的单个核细胞以2×1010/L密度悬浮于终浓度为2 μmol/L CFSE的PBS缓冲液中, 室温标记15 min(期间轻混二三次), PBS洗涤2次, 再悬浮含100 mL/L新生牛血清的RPMI1640培养液中, 同前述条件进行刺激培养, 于72 h收集细胞, PBS洗涤后固定于20 g/L多聚甲醛的PBS缓冲液中, FCM分析细胞散射光和CFSE荧光强度。

  2  结果

  2.1  Survivin蛋白的诱导表达依赖JAKStat信号通路的早期活化  为了明确刺激培养的PBMC是否发生了Stats的磷酸化修饰及与Survivin蛋白表达之间的相互关系, 我们通过Western blot检测刺激培养不同时间PBMC中Stats的磷酸化状态、 Survivin蛋白的表达以及AG490的影响作用(图1)。结果显示, 在总的Stat3和Stat5蛋白水平基本不变的情况下, 未经刺激培养的对照细胞基本检测不到磷酸化Stat3和Stat5的蛋白带, 而刺激培养12 h的细胞, 已可见磷酸化Stat3和Stat5的明显蛋白带, 并持续至64 h强度不减; Survivin蛋白带滞后出现于48~64 h; 但加有AG490刺激培养的细胞, 磷酸化Stat3和Stat5的蛋白带则明显减弱, 且直至64  h也未出现Survivin蛋白带。说明Survivin蛋白的诱导表达依赖JAKStat信号通路的早期活化。

  图1  Western blot检测刺激培养不同时间PBMC Stat3、 Stat5和Survivin蛋白的表达及AG490对表达的影响(略)

  Fig 1  The expression of Stat3, Stat5 and survivin by Western blot analysis in stimulated PBMC with or without AG490 treatment at the indicated time

  2.2  CyclinD3和CycinE周期蛋白水平上调是JAKStat信号转导与Survivin蛋白表达之间的级联反应  已有研究证明, 具有转录因子活性的磷酸化Stat3和Stat5可以激活多种促进细胞增殖和抑制细胞凋亡基因的转录[7]。为此, 进一步分析了相关功能分子—细胞周期调控蛋白和抗凋亡蛋白的表达情况及与Survivin蛋白表达之间的关系。Western blot检测结果(图2), 在刺激培养24 h、 Survivin蛋白尚未表达之时, 先出现了G1周期蛋白CyclinD3和CycinE表达水平的明显上调, 并随时间延后而上调幅度持续增加。但加有AG490的细胞, 2种蛋白水平的上调都受到明显抑制, 且始终未见Survivin蛋白的表达。说明CyclinD3、  CycinE是JAKstat信号转导与Survivin蛋白表达之间的级联反应分子。与此不同, 周期激酶抑制蛋白P21的水平在早期虽然也明显高于对照细胞, 但随时间延后却逐步恢复至对照水平, 而Bcl2蛋白水平则基本没有变化。更值得注意的是这2种蛋白水平均不受AG490存在与否的影响。

  图2  Western blot检测刺激培养不同时间PBMC周期调控蛋白和抗凋亡蛋白的表达及AG490对表达的影响(略)

Fig 2  The expression of the protein related cell cycle and antiapoptosis in stimulated PBMC with or without AG490 treatment at different time by Western blot analysis

  2.3  细胞周期的启动和运行引发Survivin蛋白的表达  FCM分析细胞周期的结果(图3)与CyclinD3和CyclinE蛋白水平上调所产生的周期启动效应相符合, 在刺激培养48 h和64 h, Survivin蛋白呈现表达(图2)的同时, 分别有12.23%和22.36%的细胞进入了DNA合成的S期。72 h细胞分裂增殖实验(图4)的前向角(FSC)参数显示, 约半数的细胞因蛋白质合成增加而体积增大, 代表处于生长状态的细胞; CFSE荧光强度参数显示, 出现10.86%荧光强度递减的M2和M3子代细胞, 属于已经分裂增殖的细胞。但加有AG490的样本则基本没有或少有上述变化, 反映绝大多数细胞仍然维持在静止状态。从时间效应还可看出, 细胞进入S期与Survivin蛋白的起始表达同步, 细胞进行有丝分裂伴随Survivin蛋白表达水平增加(已有多次实验结果显示这一规律), 是细胞周期启动和顺序运行引发的反应。

  图3  FCM分析刺激培养不同时间PBMC的细胞周期及AG490对细胞周期的影响(略)

  Fig 3  Cell cycle analysis of stimulated PBMC with or without AG490 treatment at different time by FCM

  图4  FCM分析刺激培养72 h PBMC分裂增殖及AG490对分裂增殖的影响(略)

  Fig 4  Cell division of PBMC stimulated for 72 hours with/without AG490 Treatment by FCM analysis

  3  讨论
    
  Stats是一族兼有信号转导和转录因子双重功能的DNA结合蛋白, 它的活化依赖JAK对其分子内酪氨酸残基的磷酸化。我们的实验结果显示, 刺激培养早期的PBMC中确实发生了JAK对Stat3和Stat5的磷酸化修饰(在另外的实验中, 2 h即可检测出磷酸化Stat3的蛋白带), JAK抑制剂AG490阻断这一反应之后, 就完全抑制了Survivin蛋白的后续表达。这一结果证明, JAKStat信号转导通路活化, 是刺激培养PBMC中Survivin蛋白诱导表达的早期事件。已有线索提示, CyclinD是多种外界信号作用于细胞周期的偶联分子, 通过激活CDK4/6, 使细胞从静止期进入G1期; 而CyclinE则激活CDK2, 促进细胞从G1向S期转换。鉴于AG490既抑制Survivin蛋白的表达, 也抑制CyclinD3和CyclinE的表达上调, 说明3种蛋白都受JAKStat信号转导通路的调控。又由于CyclinD3和CyclinE蛋白的上调反应早于Survivin蛋白起始表达的时序, 因此可以判定: CyclinD3和CycinE是诱导Survivin蛋白表达的上游反应分子。与之相反, AG490不影响P21和Bcl2蛋白的表达水平, 说明二者不是JAKStat信号通路所调控的靶分子, 也与Surviviv蛋白的诱导表达没有直接关系, 同时反映出刺激培养主要诱导了细胞增殖而并非抗凋亡的效应。
    
  相继有研究工作报道, Survivin蛋白不仅在人类胚胎和近乎所有的恶性肿瘤组织中表达, 也在增殖旺盛及代谢更新速度较快的正常细胞, 包括CD34+造血细胞、 新生血管内皮和肠黏膜细胞中表达[8], 表明Survivin蛋白是细胞进行有丝分裂不可缺少的功能分子。Jiang等[9]报道, 在体外培养、 经血清饥饿同步于静止期的野生型人胚胎纤维母细胞中, 几乎检测不到Survivin蛋白的表达, 而当补充血清使细胞重新进入细胞周期时, 则以转录激活途径诱导Survivin蛋白的表达, 并证明这种细胞周期依赖性表达与G1期Cyclin/CDK复合物磷酸化RB、   释放E2F转录因子有关。我们所采用的PBMC与胚胎纤维母细胞同属在一定条件下具有增殖能力的正常细胞, 刺激活化的PBMC同样通过启动细胞周期实现细胞增殖, 进而诱导了Survivin蛋白周期时相依赖性的表达。将我们的研究工作与上述文献报道结果结合分析, 我们认为刺激培养PBMC中Survivin蛋白诱导表达的主要分子机制是, 静止的PBMC在丝裂原PHA的刺激下, 活化为表达IL2受体的淋巴母细胞, 通过与IL2的结合, 激活了IL2受体相关的JAK, 引发Stat3和Stat5的磷酸化, 磷酸化的Stats作为转录因子促进下游靶分子CyclinD3和CyclinE的基因转录和蛋白表达, 从而激活周期素依赖的蛋白激酶CDK4/6和CDK2, 致使RB磷酸化和E2F被释放, 最终激活Survivin基因转录, 其蛋白产物参与淋巴细胞有丝分裂和克隆增殖。
    
  上述的研究工作, 深化了对Survivin蛋白在活化淋巴细胞表达调控分子机制的认识, 为以Survivin蛋白为靶分子的肿瘤治疗、 造血调控、 器官移植等应用研究提供了新的科学指导。

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