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lican8341的博客

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日志

 
 

人高迁移率族B1蛋白原核表达、 纯化及抗体制备和初步应用  

2016-06-16 22:42:07|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 原核表达并纯化人高迁移率族B1蛋白(HMGB1)免疫日本大耳白兔制备其抗体。方法: 构建原核表达质粒pRsetA2HMGB1, 转化大肠杆菌BL21(DE3), HMGB1蛋白经异丙基βD硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。融合蛋白通过Ni2+NTA树脂亲和纯化后免疫兔子制备抗体血清。以间接ELISA法检测抗体效价, Western blot和免疫荧光染色鉴定抗体特异性。结果: 成功构建原核表达质粒, 表达并纯化HMGB1蛋白。ELISA检测抗体效价为1∶16 000以上, Western blot和免疫荧光染色确定抗体具有高度特异性。结论: HMGB1蛋白和抗体的成功制备, 为下一步研究将HMGB1作为肿瘤等疾病治疗的新靶点奠定基础。

【关键词】  HMGB1; 原核表达; 抗体; 癌症

    高迁移率族蛋白(HMG蛋白)因其相对分子质量小(Mr<30 000),  在聚丙烯酰胺凝胶电泳中快速迁移而被命名。人高迁移率族B1蛋白(high mobility group box 1,  HMGB1)基因位于染色体l3q12,  它包括3个不同的功能区,  N末端(A区和B区)富含带正电荷的赖氨酸,  而C末端(C区)富含带负电荷的天冬氨酸和谷氨酸[1]。HMGB1蛋白在胞内外都有分布,  根据其分布不同而发挥不同的生物学效应。细胞核HMGB1参与构建核小体,  维持其稳定性,  同时在DNA重组、 复制、 修复和基因转录中起重要的辅助作用。细胞外HMGB1具有细胞因子特性,  它与细胞分化、 迁移、 增殖、 凋亡以及炎症反应的诱导等密切相关[2],  而且在人类病理状态下如Alzheimer’s病、 败血症、 局部缺血再灌注损伤、 关节炎和癌症中,  都伴随着HMGB1蛋白的失调。尤其是在癌症包括乳腺癌、 结肠癌、 前列腺癌、 肺癌等中,  HMGB1蛋白过表达与肿瘤的增殖和转移有关[3]。本研究中原核表达HMGB1蛋白、 纯化并制备其抗体,  为深入研究将HMGB1作为肿瘤等相关疾病治疗的新靶点起到了基础性作用。

    1  材料和方法

    1.1  材料  人淋巴细胞RNA逆转录产物,  原核表达载体pRsetA2(由本实验室在pRsetA基础上改建而成,  将EcoR I和Xho I位点调换),  大肠杆菌XL1Blue、 BL21(DE3),  肿瘤细胞系均由本实验室保存。引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成; Taq DNA聚合酶、 T4 DNA连接酶、 标准蛋白marker购自Ferments公司; 各种限制性内切酶购自TaKaRa公司; DNA marker、 日本大耳白兔、 抗GADPH抗体、 辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG购自赛尔生物科技有限公司; Ni2+NTA Superflow层析纯化树脂购自Qiagen; 异硫氰酸(FITC)标记的驴抗兔IgG购自Jackson Immunoresearch Laboratories。其他所用化学试剂均为分析纯以上产品。

    1.2  方法

    1.2.1  引物设计及目的片段的扩增  根据NCBI基因库中HMGB1编码区序列以及原核表达载体pRsetA2上的多克隆位点,  通过Primer Premier5.0软件设计上下游特异性引物如下: 5′GACGAATTCGCCACCATGGGCAAAGGAGATCCTAAG3′(划线处为EcoR I酶切位点) 5′GCTCACCTCGAGGCTTCATCATCATCATCTTCTTCTTCATC3′(划线处为Xho I酶切位点)。以人淋巴细胞RNA逆转录产物为模板进行PCR,  扩增条件为: 94℃预变性4 min,  然后94℃变性1 min、 58℃退火1 min、 72℃延伸1 min,  共31个循环,  最后72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖(10 g/L)凝胶电泳后,  由凝胶成像系统拍照并鉴定。

    1.2.2  原核表达质粒的构建  PCR回收产物和pRsetA2空载体以EcoR I和Xho I双酶切,  37℃水浴过夜后,  进行琼脂糖(10 g/L)凝胶电泳并回收,  然后在T4 DNA连接酶作用下室温连接4 h,  转化E.coli XL1Blue,  通过氨苄青霉素(Amp+)抗性筛选得到重组子。挑取阳性克隆小提质粒DNA并双酶切鉴定。

    1.2.3  pRsetA26hisHMGB1融合蛋白的诱导表达  鉴定正确的质粒转化E.coli BL21(DE3),  涂布于Amp+抗性的LB平板37℃过夜培养。然后挑取单克隆于2 mL LB中,  37℃ 230 r/min振荡培养过夜。次日按1∶20比例接种培养物到10 mL新鲜的LB中,  37℃ 230 r/min振荡培养约2 h,  直到A600=0.5-0.7。取1 mL作为诱导前对照,  其余的加入IPTG至终浓度为1 mmol/L,  30℃继续振荡培养4 h。然后5 000 g离心5 min,  去上清收集菌体,  加入Buffer B(100 mmol/L NaH2PO4,  10 mmol/L Tris·Cl,  8 mol/L urea,  pH8.0)重悬菌体后超声裂解,  10 000 g离心10 min留取上清。取部分上清加入上样缓冲液(含有100 mL/L β巯基乙醇)水浴煮沸5 min,  冰置待上样,  进行SDSPAGE电泳,  考马斯亮蓝染色分析。

    1.2.4  融合蛋白的纯化  将表达融合蛋白的菌液转接到300 mL LB中扩大培养,  并按上述条件诱导表达和裂解菌体,  然后离心将上清液加到Ni2+NTA树脂中,  4℃旋转混匀30 min,  加入Buffer C(100 mmol/L NaH2PO4,  10 mmol/L Tris·Cl,  8 mol/L urea,  pH6.3)洗涤柱床去除杂蛋白,  再加入Buffer D(100 mmol/L NaH2PO4,  10 mmol/L Tris·Cl,  8 mol/L urea,  pH4.5)洗脱目的蛋白,  最后洗脱液经磷酸盐缓冲液(PBS)透析后-20℃保存。其中每一步流下的液体取部分上样进行SDSPAGE分析。

    1.2.5  免疫兔子制备抗体血清  取200 μg蛋白与弗氏完全佐剂按1∶1比例混合后皮下注射初次免疫兔子,  以后每间隔2周,  取200 μg蛋白与弗氏不完全佐剂按1∶1比例混合加强免疫2次,  1周后兔耳缘静脉取血检测抗体效价并加强免疫1次,  如达到所需效价值7 d后取全血。

    1.2.6  间接ELISA法检测抗体效价  以终浓度为1 g/L的HMGB1蛋白包被ELISA反应孔,  一抗是作为空白对照的PBS、 阴性对照的免疫前兔血清以及倍比稀释的抗HMGB1抗体,  二抗为HRP羊抗兔IgG(1∶20 000),  最后加入底物显色后,  用酶标仪测定A450的值。结果以实验组值-空白对照/阴性对照-空白对照≥2.5为阳性,  以出现阳性反应的最高稀释度作为抗体的效价。

    1.2.7  Western blot和免疫荧光染色检测抗体特异性  (1)Western blot: SDSPAGE电泳后将蛋白电转(4℃,  恒流300 mA,  2 h)到硝酸纤维素膜(NC)上,  然后将NC膜在含50 g/L脱脂奶粉的TBST中室温封闭2 h后,  加抗HMGB1抗体(1∶200)室温作用3 h,  TBST洗去未结合一抗,  再加HRP羊抗兔IgG二抗(1∶1 000)室温作用1 h,  TBST洗去未结合二抗,  加底物反应3 min后暗室曝光并观察结果。(2)免疫荧光染色: 将细胞接种于14孔板中,  细胞密度为2 000~4 000/孔,  37℃孵育过夜。24 h后加40 g/L多聚甲醛4℃作用30 min固定细胞,  再加入5 mL/L TritonX100[4],   4℃透化处理20 min。然后加100 mL/L驴血清封闭1 h后,  加抗HMGB1抗体(1∶50)4℃作用过夜。次日加FITC驴抗兔IgG二抗(1∶200)4℃作用1 h,  再加DAPI 4℃染色5 min,  最后加封片剂,  荧光显微镜下观察并拍照。

 2  结果

    2.1  PCR扩增的目的片段  经特异性引物进行PCR扩增后,  琼脂糖凝胶电泳可得到644 bp的目的条带(图1)。

    2.2  验证原核表达质粒  重组质粒pRsetA2HMGB1经EcoR I和Xho I双酶切后出现644 bp的目的条带(图2),  说明重组质粒构建成功。图2  pRsetA2HMGB1原核表达质粒的酶切鉴定

    2.3  鉴定诱导表达的HMGB1蛋白  将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),  以IPTG诱导蛋白表达,  表达产物经SDSPAGE电泳后考马斯亮蓝染色在Mr约为30 000处可见一明显蛋白条带(图3)。且与预期蛋白大小相符,  由此确定HMGB1蛋白表达成功。

    2.4  融合蛋白的纯化  融合蛋白经Ni2+NTA树脂亲和纯化后进行SDSPAGE,  结果显示目的蛋白得到了高度纯化,  纯度可达90%以上,  而且经标准蛋白BSA标化后浓度约为1 g/L(图4)。

    2.5  抗体效价的检测  通过间接ELISA法进行检测后,  抗体效价可达到1∶16 000,  而作为阴性对照的免疫前兔血清显色呈阴性。

    2.6  抗体特异性的分析  (1)用纯化的HMGB1蛋白免疫兔子后得到兔抗人HMGB1抗体,  Western blot分析显示此抗体可特异性与大肠杆菌经IPTG诱导所产生的HMGB1蛋白结合,  与菌体其他成分无交叉反应(图5A)。(2)HMGB1蛋白在多种肿瘤中都有表达,  收集肿瘤细胞系前列腺癌PCM2B4、 肺癌A549、 乳腺癌MDMBA231和MCF7、 结肠癌SW620、 宫颈癌HeLa、 白血病Jurkat细胞裂解物,  采用Western blot检测发现在Mr约为30 000处出现目的条带,  与文献报道的蛋白大小相符[5],  表明此抗体可特异性识别内源性HMGB1蛋白 (图5B)。(3)在MDMBA231和A549细胞中,  免疫荧光染色显示HMGB1蛋白存在于细胞质中,  说明此抗体具有结合天然抗原的能力(图6)。

    3  讨论

    HMGB1蛋白是近几年发现的与肿瘤生长、 迁移、 侵袭密切相关的染色质蛋白,  而且相对正常组织来说,  它在多种肿瘤组织中是过表达的[3]。肿瘤细胞在侵袭转移期间HMGB1蛋白会与其配体晚期糖基化终产物受体(receptor for advanced glycation end products,  RAGE)相互作用,  激活MAPK、 P38MAPK,  JNK和P42/P44MAPK等信号通路,  继而引起基质金属蛋白酶MMP2和MMP9激活,  使细胞外基质降解促进肿瘤浸润和转移[6]。这表明如果人为阻断信号途径可能会抑制肿瘤的迁移,  而其中应用抗HMGB1抗体降低HMGB1水平是直接而有效的途径之一。最早应用抗HMGB1抗体是在炎症反应实验中,  实验发现抗HMGB1多克隆抗体可使LPS致死量攻击的小鼠生存率由0升至70%,  并且随着抗体剂量的加大,  最终可达100%[7]。同时抗HMGB1多克隆抗体也可明显减轻关节炎症状、 改善体重下降和关节组织的病理改变[8]。新近研究也显示,  应用抗HMGB1抗体进行干预后,  对严重内毒素血症、 脓毒症、 关节炎以及内毒素诱导的急性肺损伤均有积极的治疗作用。即使抗HMGB1抗体应用时机较晚,  仍可显著改善动物症状和预后[9]。这些研究为抗HMGB1抗体应用于炎症、 肿瘤等相关疾病治疗提供了实践基础,  使抗体治疗成为可能。

    利用基因工程技术表达外源蛋白选择合适的表达载体是至关重要的。具有T7启动子的原核表达载体pRsetA2,  在未诱导前转录不启动,  蛋白不会泄漏表达,  不会影响宿主菌的生长。同时此载体N端带有6His,  即有利于纯化HMGB1融合蛋白,  又可增强免疫原性制备抗HMGB1抗体。本研究选用此载体成功构建了原核表达质粒pRsetA2HMGB1,  纯化HMGB1蛋白并制备了其抗体。经间接ELISA法检测该抗体效价可达1∶16 000,  Western blot和免疫荧光染色确定,  抗HMGB1抗体不仅可以和原核表达的HMGB1蛋白特异性结合,  而且也可与多种肿瘤细胞系中内源性的HMGB1蛋白特异性结合。这为更深入研究与HMGB1蛋白相关疾病创造了有利条件。

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