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日志

 
 

NR2B反义寡核苷酸对大鼠海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响  

2016-07-16 23:02:17|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  NMDA受体 
  摘要 :目的  观察NMDA受体2B亚单位(NR2B)反义寡核苷酸(ANR2B)对海马CA1区NR2B蛋白质表达的影响,筛选有效的反义寡核苷酸,为探讨针对NR2B的新药物提供形态学基础。 方法  设计、筛选、合成ANR2B。正常SD大鼠,海马CA1区立体定位注射ANR2B,灌注取脑,连续冰冻切片,ABC免疫组织化学方法染色,光镜下观察NR2B蛋白质的表达变化。 结果  注射ANR2B后,注射区及其周围NR2B免疫组织化学染色强度明显下降,仅有少量锥体细胞和颗粒细胞散在分布;而在注射NR2B正义寡核苷酸(SNR2B)、生理盐水及生理盐水插针不注射的海马切片上,海马CA1区的染色特征与注射ANR2B者有明显差别,其作用区锥体细胞、颗粒细胞及顶树突的NR2B免疫组织化学染色强度无明显变化。 结论  ANR2B能够降低NR2B蛋白质在正常大鼠海马CA1区的基础性高表达。 
      
  关键词 :NMDA受体;反义寡聚核苷酸;免疫组织化学;海马;大鼠 
     
     
  Abstract:Objective To probe into the effect of antisense oligonucleotide on NMDA receptor2B(ANR2B)in CA1sub-field of normal rat hippocampus as a basic approach to the new drug regulating the expression of NR2B protein.Methods ANR2B and sense oligonucleotide to NMDA receptor2B(SNR2B)were prepared and injected into the normal rat hippocampal CA1subfield under well controlled conditions.Serial cryosections of the brain were processed by ABC immunohistochemistry to examine the NR2B expression.Results The immunoreactivity of NR2B expression was obviously decreased in CA1subfield af-ter ANR2B injection(P<0.05),leaving only a few pyramidal and granular cells faintly stained.But the intensity of immunore-activity was not altered at all in the control cases of normal tissue,normal saline injection,shame injection and SNR2B injec-tion.Conclusion It is likely that the high basal expression of NR2B in the normal rat hippocampal CA1subfield can be down-regulated by using the antisense oligonucleotide technique. 
     
  Key words:NMDA receptor;antisense oligonucleotide;immunohistochemistry;hippocampus;rat 
        
  N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor,NMDAR)是兴奋性氨基酸的一种特异性受体,不仅与突触发育、兴奋性传递、神经元变性等有关,而且NMDA受体介导的神经兴奋性在缺血性脑损伤中起关键性作用[1] 。海马是大鼠前脑的重要结构之一,和学习、记忆等一系列重要生理活动密切相关。在严重的短暂性前脑缺血后,海马CA1区将产生迟发性的神经元坏死,而齿状回则对 缺血性损伤具有抵抗作用,不易出现神经元坏死。NMDA受体2B亚单位(NR2B)在海马CA1区的基础性高表达可能是CA1区缺血易损性的原因之一[2] 。目前,亚单位相对特异性的拮抗剂在选择性保护神经元方面以及毒副反应上存在许多问题[3] 。反义寡核苷酸技术是目前所知具有精确、高效、特异的基因调节手段。本实验将反义寡核苷酸技术引入干预NR2B蛋白质表达的研究,筛选出针对NR2B mRNA的特异性有效反义寡核苷酸,寻找干预NR2B蛋白质表达的新手段。 
      
  1 材料和方法 
      
  1.1 NR2B反义寡核苷酸(ANR2B)、NR2B正义寡核苷酸(SNR2B)  根据NR2B的基因序列,用Biognos-tik专用软件设计筛选针对翻译起始区的反义寡核苷酸及相应的正义寡核苷酸,序列为:ANR2B:5′-CTT CAT CTT CAG CTA GTC GG-3′;SNR2B:3′-GAA GTA GAA GTC GAT CAG CC-5′。由美国GIB-CO公司合成。 
      
  1.2 试验动物及分组  健康雄性成年SD大鼠,体重250~300g,由徐州医学院实验动物中心提供。实验动物随机分为5组:注射ANR2B组(ANR2B组,n=6),注射SNR2B组(SNR2B组,n=6),注射生理盐水组(NS组,n=6),插针(有生理盐水)不注射组(NSNO组,n=6),正常对照组(不插针、不注射组,NO组,n=6)。 
      
  1.3 定位注射  0.4%戊巴比妥钠(10ml.kg)腹腔麻醉,固定于鼠脑立体定位仪上,作颅顶正中切口,以5μl微量注射器经套管连于注射针(外径210μm)作为注射装置,进行立体定位,依据George Paxi-nos的方法,确定海马CA1区立体定位注射坐标为:前囟后3.7mm,旁开1.2mm,深3.6mm。后在相应颅骨凿一小孔,进行定位注射,注射量为5μl(3mmol.L),10min内匀速注射完后留针10min,关闭伤口,饲养48h。 
      
  1.4 取材切片  动物用0.4%戊巴比妥钠(10ml.kg)腹腔麻醉,经心-升主动脉快速灌注生理盐水150ml,继之以4%多聚甲醛(pH7.4,4℃)300ml灌注,30min内灌完,灌注后的大鼠断头、暴露脑,在立体定位仪上,将鼠脑冠状位分成前、中、后3段。取含针道的海马中段入原液内后固定(12h,4℃),依次浸入15%、30%蔗糖(各12h,4℃)。做前脑连续冰冻切片,片厚30μm,切片分组收集。 
      
  1.5 免疫组织化学反应  ①新鲜配制3%H 2 O 2 (0.3%的Triton X-100.PBS稀释)室温,10min。②10%正常兔血清(0.3%的TritonX-100.PBS稀释),室温,30min。③NR2B多克隆一抗(美国Santa Cruz公司),1∶200,72h,4℃。④生物素化二抗(美国Vector公司),1∶200,12h,4℃。⑤ABC液(美国Vec-tor公司),1∶200,A∶B=1∶1,1h,37℃。⑥二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)反应0.3%DAB,0.03% H 2 O 2 ,室温,10min(镜下观察呈色反应)。⑦贴片、 干燥、脱水、透明、封片。各步空白对照切片用0.01mol.L PBS代替一抗,其他反应步骤相同,各组均为阴性。 
      
  1.6 图像处理  采用德国LEICA QWin图像处理和分析系统对免疫组织化学反应的强度进行灰度测量,以便半定量分析。测量时,选取3轮动物实验的切片,每轮包含NO、NS、NSNO、SNR2B、ANR2B,检测海马CA1区药物作用区灰度值。以相应的背景灰度值减去各测量点灰度值后的平均值作为海马各区的最终灰度值。 
      
  1.7 统计学处理  结果采用SPSS统计软件进行统计分析,以两样本均数间t检验及单因素方差分析(ANOVA)中多样本均数间两两比较等方法,进行统计学处理,P<0.05表示差异有显著性。 
      
  2 结果 
      
  2.1 NR2B免疫组织化学染色特征  镜下观察,在CA1区,锥体细胞胞膜着色较强而胞质染色淡,放射层及腔隙分子层的顶树突染色强度和锥体细胞胞膜呈基本相同的较强染色,从胞体一直延伸到海马裂(图1)。在CA3区,胞膜染色较强,胞质染色较淡,透明层及放射层的顶树突基本不着色(图2),仅基部存在着色。齿状回颗粒细胞密集排列,染色也以胞膜为主,胞质染色淡,呈现小空泡状(图3)。 
      
  2.2 ANR2B对NR2B蛋白质表达的影响  正常大鼠海马CA1区注射ANR2B48h后,注射区及其周围NR2B免疫组织化学染色强度明显下降(灰度值6.5±1.9,P<0.01),仅为未注射区的17.8%(图9)。仅有少量锥体细胞和颗粒细胞散在分布,有时在注射区底部尚可以见到顶树突的着色,药物作用区周围细胞胞膜及顶树突着色反应性增强,与注射区的低表达呈鲜明的对比(图4)。 
      
  2.3 SNR2B对NR2B蛋白质表达的影响  正常大鼠海马CA1区注射SNR2B48h后,注射点周围锥体细胞、顶树突的NR2B免疫组织化学染色强度与CA1区其他部位无统计学意义变化(灰度值37.9±11.4),为未注射区的103.5%,细胞形态,顶树突着色也没有明显变化(图5)。 
      
  2.4 NS、NSNO对NR2B蛋白质表达的影响  正常大鼠海马CA1区立体定位注射NS及NS插针不注射48h后,注射点周围锥体细胞形态正常,免疫组织化学染色强度与CA1区其他部位无统计学意义变化(NS灰度值36.2±7.5,NSNO灰度值33.8±6.9)分别为未注射区的98.9%、92.3%(图6、7)。 
               
  图1  CA1区NR2B(免疫组织化学染色,×200) (略) 
  图2  CA3区NR2B(免疫组织化学染色,×200) (略) 
  图3  DG区NR2B(免疫组织化学染色,×200)(略) 
      
  图4  注射ANR2B后CA1区NR2B(免疫组织化学染色,×200) (略) 
  图5  注射SNR2B后CA1区NR2B(免疫组织化学染色,×200)(略) 
      
  图6  插针但不注射(NSNO)CA1区NR2B(免疫组织化学染色,×200) (略) 
  图7  注射NS后CA1区NR2B(免疫组织化学染色,×200) (略) 
  图8  空白对照切片(×200)(略) 
  
  图9  不同组海马CA1区NR2B蛋白质表达与NO组比较:*P<0.01;与NS组、NSNO组、SNR2B组比较:#P<0.01(略)
3 讨论 
      
  谷氨酸是脊椎动物中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质,它在脑中的众多功能是由不同的受体介导的。谷氨酸受体根据其药理学特征可分为离子型(ionotropic)和代谢型(metabotropic)两大类。其中离子型谷氨酸受体又可以分为NMDA受体和非NM-DA受体。NMDA受体是一个异聚体复合物,形成配基门控离子通道。在这个异聚体复合物中,有3个基因家族,分别编码NR1、NR2和NR3,其中NR1是受体复合物的功能亚单位,是Ca2+ 通道的主要调节者[4] ,在中枢神经系统内广泛分布。NR2有4个独立的基因即NR2A、NR2B、NR2C、NR2D,他们是受体复合物的调节亚单位,在脑内呈特异性分布,决定受体的电生理学和药理学特性。NR1的不同剪接变异体和NR2的不同亚型组成二聚体、三聚体,也可形成四聚体或五聚体的功能性受体通道。其中NR2B参与形成的受体复合物(40%),具有配体的高结合力和较高的酪氨酸磷酸化水平[5] 。在大脑的酪氨酸激酶基因家族(fyn、src、yes、abl)中只有fyn能影响NR2B的酪氨酸磷酸化程度[6] ,用WesternBlot及免疫印迹的方法发现,fyn及其底物高度集中在大鼠前脑尤其是海马的突触后致密带(post synaptic density,PSD)上,而且其中2个主要的底物之一的PSD-180蛋白被证实是NR2B。NR2B上有2个位点(Y1105和Y1107)可被磷酸化[7] 。 
     
  NR2B在正常大鼠海马CA1区的基础性高表达,以及缺血性脑损伤后的病理性表达变化,是CA1区缺血易损性的主要原因。既往对此问题的研究多借助于受体的拮抗剂和激动剂,尤其是拮抗剂,但由于NMDA受体的拮抗剂在临床前期试验中表现兴奋毒性,而且David等[8] 认为现有NMDA受体拮抗剂和激动剂的选择性还不能揭示其亚单位的分子特性,故其应用受到一定限制。现代分子生物学特别是基因克隆、测序、核酸合成技术的发展,为这一问题的研究提供了新的思路。从理论上讲,若能选择适宜的时间窗口[9] 抑制NR2B亚单位的基础性高表达,降低病理性表达变化,就能减少缺血时钙内流,有效得阻止NMDA受体介导的缺血性脑损伤。根据遗传中心法则,不管蛋白质的表达和mRNA的表达结果是否一致,蛋白质的表达最终是由其相应mRNA的翻译所决定,而mRNA的产生则由其相应的DNA的转录而成。若能从源头上、基因水平抑制DNA复制和转录、阻断mRNA加工、成熟、出核及翻译,就可以降低NR2B蛋白质表达水平,本研究的结果对此给予了解释。本研究发现,正常大鼠海马CA1区给予ANR2B后,在ANR2B作用区,NR2B免疫组织化学染色强度明显下降,说明NR2B蛋白质表达水平下降,也就是说ANR2B能够降低NR2B在正常大鼠海马CA1区的基础性高表达,而且通过设置对照,可以肯定这种效应是由反义机制引起。 
     
  同类事件也发生在NMDARP-71的反义寡核苷酸或者碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)处理的12~44h的海马培养细胞中,Northern和Western印迹杂交法证实NMDARP-71蛋白质的表达受到抑制[10] 。但是NMDA受体在转录和翻译水平的表达调控过程复杂,受到多因素影响。Sucher等[11] 发现NMDAR1mRNA在嗜铬肿瘤PC12细胞中的表达类似于在海马神经元,用NMDAR1的单克隆抗体显示NMDAR1在PC12细胞中的表达可能存在翻译后调控机制,认为NMDAR1mRNA在某些细胞内并不一定代表有NMDAR1蛋白质的表达。因此,NR2B蛋白质表达下降是否完全由其mRNA水平下降引起需要进一步实验研究。  
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