注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响  

2016-07-20 22:47:53|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

【摘要】  目的 研究NMDA受体亚单位2A(NR2A)反义寡核苷酸对短暂性脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区NR2A及其mRNA表达的影响,探讨其在脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马神经元损伤中的可能作用机制。方法 健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组、假手术对照组和缺血/再灌注组。经生理盐水、错义寡核苷酸和反义寡核苷酸预处理后,以四血管阻断法建立短暂性前脑缺血(15 min)再灌注(24 h、48 h和72 h)动物模型。在确定的时间点进行灌注固定、取材、石蜡包埋和组织切片(片厚8 μm),然后行原位杂交和免疫组织化学染色。结果 短暂性脑缺血/再灌注后,大鼠海马CA1区NR2A mRNA的表达显著增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);NR2A反义寡核苷酸能显著地抑制这种表达的增加(P<0.05)。短暂性脑缺血/再灌注后,大鼠海马CA1区NR2A的蛋白表达显著降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);经NR2A反义寡核苷酸预处理后,能够进一步增强NR2A蛋白表达的降低,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论 短暂性脑缺血/再灌注后,在大鼠海马CA1区存在转录增强而翻译抑制现象。NR2A反义寡核苷酸能特异性地抑制NR2A mRNA表达的增加,同时能够增强NR2A蛋白表达的降低。NR2A反义寡核苷酸的这种作用很可能与缺血后的翻译抑制以及海马CA1区选择性易损伤相关联。

【关键词】  脑缺血;NR2A反义寡核苷酸;NR2A;NR2A mRNA;翻译抑制

  Abstract: Objective To investigate the effect of NMDA receptor subunit 2A (NR2A) antisense oligodeoxynucleotides on the expression of NR2A and its mRNA in rat hippocampal CA1 region following transient cerebral ischemia/reperfusion, and to further probe into the possible mechanism of neuronal cell injury induced by cerebral ischemia and reperfusion in rat hippocampus. Methods Healthy male SD rats were randomized into normal control group, sham operation control group and ischemia/reperfusion group. Following pretreatment with saline, missense oligonucleotide and antisense oligonucleotide, the four-vessel occlusion method was employed to establish transient forebrain ischemia (15 min) and reperfusion (24 h, 48 h and 72 h) animal models. In determining time, the rats were anesthetized, and then underwent perfusion fixation, sample preparation, paraffin-embedding and tissue sections (8 μm of slice thickness). The slices were processed by in situ hybridization staining and immunohistochemical staining. Results Following transient cerebral ischemia/reperfusion, the expression of NR2A mRNA significantly increased in CA1 subfield of rat hippocampus (P<0.05) and the NR2A antisense oligonucleotides could significantly inhibit the increase of this expression (P<0.05). Subsequent to transient cerebral ischemia/reperfusion, the expression of NR2A protein significantly decreased in CA1 subfield of rat hippocampus (P<0.05) and pretreatment with NR2A antisense oligonucleotides could further strengthen the reduction of NR2A protein expression (P<0.05). Conclusion Following transient cerebral ischemia/reperfusion, there was the phenomenon of transcription enhancement and translation inhibition in CA1 region of rat hippocampus. NR2A antisense oligonucleotides could specifically inhibit the increase in NR2A mRNA expression, and could simultaneously strengthen the reduction in NR2A protein expression. The effect of NR2A antisense oligonucleotides may be related to the translation inhibition and selective vulnerability in hippocampal CA1 region following ischemia.

  Key words: cerebral ischemia; NR2A antisense oligonucleotides; NR2A mRNA; NR2A; translation inhibition

  缺血性脑损伤能够诱导谷氨酸释放增加和(或)摄取减少,突触后谷氨酸受体过度刺激,引起Ca2+异常内流而导致胞内钙超载,超载的Ca2+激活其靶酶,造成自由基积累,并形成恶性循环,最终导致神经细胞的损伤和死亡,这就是所谓的谷氨酸兴奋毒性[1-2]。可见,谷氨酸过度激活其受体是缺血性脑损伤的关键环节。N-甲基-D-天门冬氨酸受体(N-methyl-D-aspartate receptor, NMDAR, NR)作为离子型谷氨酸受体的主要类型,是一种配基门控的阳离子通道,是引起Ca2+内流而诱导产生兴奋毒性的主要受体[3-4]。构成NMDA受体的亚单位常以受体复合物的形式存在,其中NR2是受体复合物的调节亚单位,不同NR2的参与可以赋予通道复合物以不同的电生理学和药理学特性[5]。尽管已经明确NMDA受体介导的谷氨酸神经兴奋毒性在缺血性脑损伤的众多环节中起着关键性的作用[6-7],但目前有关NMDA受体调节亚单位2A(NR2A)在缺血性脑损伤中的确切作用机制和作用环节仍不明确,关于NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响尚鲜见文献报道。本研究探讨NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响,并探讨其在脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马神经元损伤中的可能作用机制,为临床脑血管病的预防和治疗以及研制和开发针对NR2A的特异性新药提供理论基础和形态学依据。

  1 材料和方法

  1.1 主要试剂和仪器 NR2A反义寡核苷酸序列:5′-CA GTA GCC CAA TCT GCC CAT-3′,NR2A错义寡核苷酸序列:5′-AT GGG CAG ATT GGG CTA CTG-3′(美国GIBCO)。多克隆羊抗-NR2A(美国Santa Cruz),兔抗山羊IgG抗体(英国Abcam)。原位杂交试剂盒(武汉博士德),浓缩型DAB试剂盒(北京中杉)。石蜡切片机(德国Leica),显微摄影系统(日本奥林巴斯),立体定位仪(日本成茂),图像分析软件(美国Media Cybernetics)。

  1.2 实验动物及分组 健康雄性SD大鼠,体重220~280 g,购自徐州医学院实验动物中心(清洁级,合格证号:苏SYXK2002-0038)。随机分为正常对照组(NC)、假手术对照组(Sham)和缺血/再灌注组(I/R);I/R组又分为I/R 24 h、I/R 48 h和I/R 72 h组。各组动物又分别分为反义组(AS)、错义组(MS)和溶剂组(TE)。每小组的实验动物数皆为5,即n=5。

  1.3 给药处理 在脑缺血前3天经侧脑室给药,每天1次。参照Paxinos & Watson所著的《The rat brain in stereotaxic coordinates》选取侧脑室立体定位坐标(以Bregma为参照,后0.8 mm,侧1.5 mm,深3.5 mm)[8]。每次给药量为10 μl(100 μg NR2A反义寡核苷酸溶解在10 μl TE缓冲液中)。错义组与溶剂组分别在相同部位注射相同剂量的错义寡核苷酸和溶剂(TE)。

  1.4 模型建立 以改良的四动脉阻断法建立短暂性前脑缺血(15 min)再灌注动物模型[9-10],再灌注时间为24 h、48 h和72 h。Sham组大鼠除不电凝椎动脉和不夹闭双侧颈总动脉外,其他手术过程同I/R组。

  1.5 灌注固定及切片制备 大鼠常规麻醉,经心-升主动脉插管灌注固定。取含海马的脑块入后固定液(4℃,过夜),然后常规梯度乙醇脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋。包埋脑块作连续冠状切片,片厚8 μm,切片分4套,分别进行原位杂交和免疫组织化学染色以及阴性对照染色。

  1.6 原位杂交染色 原位杂交按试剂盒说明书和本实验室方法进行[11],主要步骤如下:以3%H2O2灭活内源性过氧化物酶,用3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶消化;预杂交(37℃、3 h)和杂交(41℃、24 h);杂交后洗涤;以5%BSA封闭非特异性结合位点;加生物素化鼠抗地高辛;加SABC-POD;加生物素化POD;以DAB/H2O2显色。阴性对照以0.5 mol/L PBS替代含探针杂交液进行杂交,其余步骤相同。

  1.7 免疫组织化学染色 以EDTA抗原修复液行微波修复,加3% H2O2(室温、10 min),水洗,10%兔血清(室温1 h),加一抗(1∶100,以含0.3% Triton X-100的0.01 mol/L PBS稀释,4℃,48 h),水洗,加生物素化兔抗山羊IgG(1∶200,37℃,30 min),水洗,加辣根过氧化物酶标记链酶卵白素液(1∶200,37℃,30 min),水洗,DAB/H2O2显色。阴性对照以一抗稀释液替代一抗,其余步骤相同。

  1.8 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两组间比较采用LSD-t检验,以P<0.05 表示差异有统计学意义。

  2 结 果

  2.1 NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区NR2A mRNA表达的影响 原位杂交结果显示,在I/R 24 h、I/R 48 h和I/R 72 h,大鼠海马CA1区NR2A mRNA的原位杂交强度显著增加,与Sham组相比差异有统计学意义(P<0.05);组间比较未见显著性差异。给予NR2A特异性反义寡核苷酸预处理后,能够明显抑制这种原位杂交强度的增加,与各自的MS组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表1。表1 NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区NR2A mRNA表达的影响(n=5,±s)表中灰度值为海马CA1区相同部位、相同单位面积内的背景灰度值减去各测量点灰度值后的平均值。与Sham组比较:*P<0.05;与同组内MS组比较:#P<0.05

  2. 2 NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区NR2A蛋白质表达的影响 免疫组织化学研究显示,在I/R 24 h、I/R 48 h和I/R 72 h,大鼠海马CA1区NR2A蛋白质的反应强度明显减弱,减弱的幅度依次增加,与Sham组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。给予NR2A特异性反义寡核苷酸预处理后,能进一步增强这种免疫组织化学反应强度的减弱,与各自的MS组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。I/R 48 h和I/R 72 h与I/R 24 h比较,差异有统计学意义(P<0.05)。见图2、表2。表2 NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马CA1区NR2A蛋白质表达的影响(n=5,±s)表中灰度值为海马CA1区相同部位、相同单位面积内的背景灰度值减去各测量点灰度值后的平均值。与Sham组比较:*P<0.05;与同组内MS组比较:# P<0.05;与I/R 24 h组比较:△P<0.05

  3 讨 论

  NR2A亚单位实际上也许在谷氨酸兴奋毒性中比NR2B亚单位起到更为关键的作用,已经证明谷氨酸对新生鼠CA1区神经元的易损性很低,但对生后3个月的大鼠却很高,这表明NR2A的表达增加了谷氨酸的兴奋毒性[12-13]。文献报道在脑缺血小鼠模型中选择性敲除NMDA受体ε1(NR2A)亚单位后能够减轻缺血引起的细胞损伤程度,说明NR2A参与了缺血性脑损伤过程[14]。近年关于NR2拮抗剂的研究发现,这类化合物具有一定的亚型选择性,其亲和力排序为:NR2A>NR2B>NR2C>NR2D[15]。Novartis公司研制的化合物NVPAAM077是一种具有较强选择性的竞争性拮抗剂,能选择性阻滞NR2A,该物质对NR2A的选择性较对NR2B的选择性高很多倍[16]。以上研究表明,NR2A在缺血性脑损伤中可能发挥比NR2B更为重要的作用,针对NR2A及其拮抗剂或激动剂的研究将成为热点。目前,NR2A在缺血性脑损伤中的确切作用机制仍不明确,关于NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响尚鲜见文献报道。尽管有小干扰RNA出现,但对于在体研究而言反义寡核苷酸技术仍不失为一种在基因水平进行相关研究的重要方法[17]。既往研究发现,在缺血/再灌注24 h、48 h和72 h,大鼠海马CA1区NR2A mRNA的表达呈明显的增高趋势[18],故本研究选择这3个时间点。本研究综合应用反义技术、动物模型、立体定位注射以及原位杂交和免疫组织化学等方法,研究NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注大鼠海马NR2A及其mRNA表达的影响;探讨其在脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马神经元损伤中的可能作用机制,为研制和开发针对NR2A的特异性新药以及临床脑血管疾病的预防和治疗提供理论基础和形态学依据。

 研究发现,在脑缺血/再灌注24 h、48 h和72 h,大鼠海马CA1区NR2A mRNA的表达显著增加,且NR2A反义寡核苷酸能够明显抑制这种表达的增加。缺血后调节亚单位NR2A mRNA表达的增加,很有可能在mRNA水平诱导某些凋亡相关基因如Bad、Bax、Fas、caspase和IEGs等的异常表达以及相关激酶如c-jun的异常磷酸化,从而参与脑缺血/再灌注诱导的细胞损伤和死亡[19-20]。NR2A反义寡核苷酸抑制缺血后NR2A mRNA表达的增加,一方面说明这种针对NR2A mRNA的反义寡核苷酸具有特异性和有效性,为探索缺血性脑损伤的反义治疗提供了形态学依据;另一方面间接说明了NR2A反义寡核苷酸特异性阻断缺血后NR2A mRNA的表达很有可能对脑缺血/再灌注诱导的大鼠海马CA1细胞损伤具有重要的神经保护作用。

  本研究还发现,在短暂性脑缺血/再灌注24 h、48 h和72 h,大鼠海马CA1区NR2A蛋白质的表达明显减弱且减弱的幅度依次递增;NR2A反义寡核苷酸能够进一步增强这种表达的减弱。这说明NR2A反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注后大鼠海马CA1区蛋白质的表达具有显著的抑制作用,进一步证明NR2A反义寡核苷酸作为药物使用的有效性。结合本课题组的既往研究[18,21],有力地证明短暂性脑缺血/再灌注以后在易损伤的大鼠海马CA1区存在转录和翻译不平行即转录增强而翻译抑制现象。文献认为,翻译和转录不平行这一现象不仅是时间依赖性的,而且很可能是细胞特异性的,对缺血高度敏感的易损神经元中存在翻译抑制现象,且该现象往往发生在易损的神经元坏死之前[22-23]。本研究证实了这一论点,不但证明在缺血性脑损伤中存在翻译抑制现象,而且证明NR2A参与了这一过程,提示NR2A在脑缺血/再灌注诱导的神经细胞死亡中发挥极其重要的作用。脑缺血/再灌注过程中,产生转录和翻译不平行这一现象的原因显然与脑缺血时蛋白质的翻译而非转录减弱有关。目前,缺血性脑损伤易损神经元翻译抑制的机制尚不清楚,但在翻译抑制和神经元易损性这一惊人的联系中,前者可能在导致缺血性细胞死亡的级联反应中发挥更为关键的作用[23-24]。本研究提示,如果在缺血性脑损伤的进程中采取适当的方式抑制易损神经元的这种翻译抑制,也许能有效地抑制易损神经元的凋亡和坏死。这也为未来缺血性脑损伤神经保护机制的研究提供了一个新的方向。

  以上结果提示,短暂性脑缺血/再灌注后,在大鼠海马CA1区存在转录增强而翻译抑制的现象。NR2A反义寡核苷酸能特异性地抑制NR2A mRNA表达的增加,同时能够增强NR2A蛋白表达的降低。至于NR2A参与翻译抑制的具体机制及其与海马CA1区选择性易损伤以及反义抑制之间的关系,有待从蛋白质组学和基因组学方面做进一步深入研究。

  评论这张
 
阅读(10)| 评论(0)
推荐 转载

历史上的今天

在LOFTER的更多文章

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2017