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日志

 
 

形虫三磷酸核苷水解酶基因的克隆与序列分析  

2016-07-20 23:07:05|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的:克隆并分析我国刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶(NTPase)的编码基因。方法:采用聚合酶链反应(PCR)扩增弓形虫RH株的NTPase基因,克隆入pGEM-T Easy载体,转化后挑取阳性克隆进行酶切与测序鉴定,并对获得的NTPase基因及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果:PCR扩增得到特异的弓形虫NTPase基因序列,测序结果表明,获得的弓形虫NTPase-Ⅱ基因全长1 812 bp,编码的603个氨基酸与Genebank报道的氨基酸序列同源性为100%。经DNAStar预测NTPase-Ⅱ存在6个潜在抗原表位。结论:成功克隆出序列正确的弓形虫NTPase-Ⅱ基因,为其相关研究奠定了基础。

【关键词】  弓形虫 核苷水解酶 克隆 序列分析

   
    Abstract:  Objective:To clone and analyze the nucleoside triphosphate hydrolase (NTPase) gene of Toxoplasma gondii. Methods: The NTPase gene was amplified by polymerase chain reaction (PCR) from RH strain of Toxoplasma gondii and cloned into pGEM-T Easy vector. Positive clones were screened and identified by BglⅡ、HindⅢ digestion and sequenced. The DNA sequence and its deduced protein sequence were analyzed. Results: The NTPase gene was specifically amplified, DNA sequence analysis showed that the length of cloned gene was 1 812 base pair. The homology of this deduced amino acids sequence was 100% to that in the Genebank. Conclusion: The NTPase-Ⅱ gene is successfully cloned, providing basis for the future research about this gene.

    Key words:   Toxoplasma gondii; NTPase; cloning; sequencing

    刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是专性细胞内寄生的机会致病性原虫,呈世界性分布。三磷酸核苷水解酶(nucleoside triphosphate hydrolase,NTPase)为分布于弓形虫速殖子表面一种主要特异性抗原[1,2],其对虫体在宿主细胞内的寄生和繁殖都具有重要的作用[3]。目前,国内关于弓形虫病诊断和疫苗候选抗原的研究主要集中在P30(SAG1)和P22抗原[4-6],而对NTPase的研究鲜见报道。因此,我们对弓形虫RH株的NTPase基因进行扩增与克隆,为下一步的研究奠定基础。

    1  材料和方法

    1.1  虫株和试剂  弓形虫RH株由浙江省医学科学研究院寄生虫病研究所惠赠;E.coli DH5α为本室保存;pGEM-T Easy载体购自Promega公司。淋巴细胞分离液购自Sigma公司;限制性内切酶BglⅡ、HindⅢ和基因组DNA提取试剂盒均为大连宝生物产品;2×PCR Master Mix试剂盒购自上海晶美生物技术有限公司;小量质粒抽提试剂盒购自宁波中鼎生物技术公司;200 bp Marker及DNA凝胶回收试剂盒为上海生物工程技术有限公司产品。

    1.2  模板DNA制备  弓形虫RH株速殖子连续在小鼠体内传代,感染3 d后无菌操作抽取腹水,虫体用生理盐水洗涤3次,加入与虫体混悬液等量的淋巴细胞分离液,800 r/min离心8 min后加速至2 000 r/min离心10 min,收集中层虫体[7],按DNA提取试剂盒说明书抽提弓形虫基因组DNA,用分光光度法测定DNA的浓度和纯度。

    1.3  PCR扩增  根据弓形虫NTPase参考核苷酸序列[8]和表达载体克隆位点内切酶图谱分析结果,采用Primer Designer引物设计软件自行设计引物,由上海基康生物技术公司合成,引物序列如下:上游引物:5'-GAAGATCTACAGACTCATCGTCACT CCG-3'(下划线为BglⅡ酶切位点),下游引物:5'-GCAAGCTTTCACAGATTGTGAGAATATCC-3'(下划线为HindⅢ酶切位点)。采用2×PCR Master Mix试剂盒扩增NTPase基因,PCR反应总体积为50μl:其中含有模板DNA 5μl(200 ng),上下游引物各1μl(终浓度为0.4μmol/L)。同时设立空白对照。PCR反应参数:95 ℃ 5 min×1;95 ℃ 45 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s×30;72 ℃ 10 min×1。1.5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定并切胶回收。

    1.4  T-A克隆及测序  回收的PCR产物与pGEM-T Easy载体16 ℃过夜连接。连接体系为10μl:纯化的PCR产物3μl,2×buffer 5μl,pGEM-T Easy Vector 1μl,T4 DNA连接酶1μl。连接产物转化感受态E.coli DH5α,吸取200μl转化后的感受态细菌涂布于含氨苄青霉素的LB平板上,筛选阳性克隆。阳性重组子经培养和提取质粒后,分别进行BglⅡ和HindⅢ双酶切及PCR鉴定,并送上海基康生物技术公司测序。测序结果采用DNAMAN软件与Genebank公布的弓形虫NTPase基因[9]序列进行比较,并推导其编码的氨基酸序列。对获得的基因及其氨基酸序列的同源性、保守功能域、二级结构等进行生物信息学分析。

    2  结果

    2.1  PCR扩增结果  从弓形虫RH株DNA模板中扩增获得预期大小(1 812 bp)的目的条带(见图1)。

    2.2  序列测定及推导的氨基酸序列的生物信息学分析

    2.2.1  物理化学性质预测:测定的弓形虫NTPase编码区基因长1 812 bp,A+T含量为47.8%,G+C含量为52.2%,预测编码603个氨基酸,理论等电点为5.72,Mr为66 900,其中含80个碱性氨基酸(K、R、H),78个酸性氨基酸(D、E),275个非极性疏水性氨基酸(G、A、V、L、I、F、P),170个极性氨基酸(W、S、Y、C、M、N、Q、T)。获得的NTPase编码基因及推导的氨基酸序列见图2。

2.2.2  同源性分析:用NCBI的BLASTN程序对弓形虫NTPase编码基因序列进行核苷酸的同源性分析,结果显示获得的基因序列与GenBank上提交的NTPase-Ⅱ基因同源性达100%。

    2.2.3  抗原表位预测:用DNAStar软件对弓形虫NTPase-Ⅱ可能的抗原表位进行预测,NTPase-Ⅱ氨基酸序列中存在6个潜在的抗原表位(见表1)。

    2.2.4  保守功能域分析:用Expasy的ScanProsite程序分析推导的弓形虫NTPase-Ⅱ氨基酸序列的保守功能域,发现在206~221位氨基酸具有GDA1/CD39家族的核苷磷酸酶标志。氨基酸序列中还存在cAMP、cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点(aa  82~85)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点(aa 207~210、317~320、341~344、354~357、409~412、422~425、444~447、465~468、475~478、593~596)、N末端十四酰化位点(aa 47~52、208~213、239~244、254~259、303~308、324~329)、蛋白激酶C磷酸化位点(aa 5~7、13~15、26~28、50~52、74~76、223~225、273~275、379~381、465~467、475~477)、酰胺化位点(aa 80~83)、N末端糖基化位点(aa 407~410)、酪氨酸激酶磷酸化位点(aa 592~599)。

    2.2.5  二级结构预测:用Expasy的predictprotein(PROFpredictions)预测,弓形虫NTPase-Ⅱ的氨基酸二级结构α螺旋(H)与β片层(E)和卷曲环(L)之比为25.37∶15.26∶59.37,属于混合型,核心氨基酸与暴露残基之比为46.77∶53.23,卷曲环区与平均柔曲性高峰区基本一致。

    3  讨论

    弓形虫NTPase是弓形虫在宿主细胞内环境下获得嘌呤的寄生机制而产生的,对弓形虫的寄生和繁殖都具有重要的作用。体外研究发现,弓形虫产生的NTPase在二巯基化合物的激活作用下,能连续水解所有的三磷酸核苷和三磷酸脱氧核苷至单磷酸形式[3]。感染宿主细胞的弓形虫速殖子即是利用NTPase分解宿主细胞来源的ATP,以合成维持自身生存所必需的嘌呤核苷酸。

    NTPase蛋白有NTPase-Ⅰ和NTPase-Ⅱ两种亚型,组成两亚型的628个氨基酸中只有16个残基不一样,两亚型的编码基因有31个碱基不同且均不含有内含子[9]。Nakajima K等[8]曾报道,使用NTPase-ELISA试验血清学诊断急性弓形虫病与Sabin-Feldman标准染色试验具有很好的相关性,且NTPase两亚型间的抗原性并无明显区别。Kikuchi等制备的特异性抗NTPase单克隆抗体6C6可与弓形虫强毒力株和非毒力株的4种不同的NTPase异构酶分子均发生反应,即6C6可识别4种NTPase异构酶的共同表位[10]。NTPase-Ⅱ亚型存在于弓形虫的所有虫株中,且具有强抗原性和较好的免疫反应性。本实验成功克隆出NTPase-Ⅱ基因,其测序结果与Genbank登陆序列L39079比较,核苷酸序列同源性高达100%,说明NTPase-Ⅱ为高度保守基因。本实验预测得NTPase-Ⅱ蛋白具有6个潜在的抗原表位,为我们今后表达重组NTPase蛋白用于弓形虫感染的免疫诊断和疫苗候选抗原的筛选奠定了基础。

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