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lican8341的博客

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日志

 
 

反义c┐myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖  

2016-07-20 21:43:32|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  反义核酸 
    关键词: myc基因;反义核酸;大鼠;平滑肌  
    摘 要:目的  观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌增殖的抑制作用. 方法  大鼠气道平滑肌细胞原代培养,4~12代用于实验.利用Lipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠气道平滑肌细胞,MTT法检测不同寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用,RT-PCR检测c-myc mRNA的表达,免疫组织化学染色检测c-Myc蛋白的表达. 结果  反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖,且这种抑制作用呈浓度依赖性;反义c-myc寡核苷酸可降低c-myc mRNA的表达,同时降低了c-myc mRNA的翻译. 结论  反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌的增殖. 
       
  Keywords:genes,myc;oligonucleotide,antisense;rat;muscle,smooth 
      
  Abstract:AIM To observe the antiproliferative effect of c-myc antisense oligonucleotide on rat airway smooth muscle cells.METHODS Rat airway smooth muscle cells were pri-mary cultured.4~12passages were used in experiments.Lipofectin was used to transfect antisense oligonucleotide,sense oligonucleotide and mismatched oligonucleotide for c-myc to rat airway smooth muscle cells.The antiproliferative effect was assayed by way of MTT.RT-PCR was used to de-tect the expression of c-myc mRNA.c-Myc was observed by immunohistochemistry staining.RESULTS Antisense oligonucleotide for c-myc could inhibit the proliferation of rat airway smooth muscle cells,and this effect was related with concentration.Antisense oligonucleotide for c-myc could de-crease the expression of c-myc mRNA.The translation of c-myc was also decreased.CONCLUSION Antisense oligonucleotide for c-myc could inhibit the proliferation of rat airway smooth muscle cells. 
      
  0 引言 
      
  气道重塑(airway remodelling)在哮喘发病过程中有重要作用,包括气道上皮和气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells,ASMC)的增殖[1] .原癌基因是各种细胞内信号转导的最后共同通道,是参与气道重塑的重要因素.我们拟利用反义c-myc寡核苷酸阻断细胞增殖,达到抑制ASM增生、缓解气道重建的目的.  
  1 材料和方法 
      
  1.1 材料  主要试剂及仪器:Ⅳ型胶原酶、兔抗鼠actin抗体、MTT:Sigma公司;DMEM,Lipofectin,TRIZOL:Gibcobrl公司;胎牛血清:杭州四季青生物制品工程公司;Access RT-PCR试剂盒:Promega公司;核酸水平电泳仪:美国BIO-RAD公司;反义、正义及错配c-myc寡核苷酸由美国Genemed Synthe-sis,Inc.合成,其核苷酸序列分别如下:5’CAC GTT GAG GGG CAT3’,5’CAC GTG GAG TGG CAT3’和5’ATG CCC CTC AAC GTG3’,每条寡核苷酸的末端两个碱基间行硫代修饰.另合成5’端FITC标记的反义c-myc寡核苷酸.  
  1.2 方法 
      
  1.2.1 大鼠ASMC的分离与培养  健康、雄性SD大鼠1只(第四军医大学实验动物中心提供),体质量260g,脊椎脱臼法处死,无菌剥离气管及气管内、外膜,剪碎剩余组织块约为1mm×1mm×1mm大小,2g?L-1 Ⅳ型胶原酶37℃消化2次,每次30min,中间吹打组织块1次,100目不锈钢滤网过滤.100mL?L-1 胎牛血清高糖DMEM培养. 
      
  1.2.2 ASMC的纯化  经原代培养后,细胞呈多克隆生长,选择细胞形态呈梭形的克隆在倒置显微镜下机械分离.分离所得细胞继续培养1代,2.5g?L-1 胰酶短暂消化,1∶3传代,静置细胞30min,去除未贴壁细胞,利用平滑肌细胞容易贴壁的特性进一步纯化所得细胞. 
      
  1.2.3 大鼠ASMC的鉴定  ASMC离体培养时呈梭形,有较长的突起,细胞核位于细胞中央,排列成旋涡状、放射状或栅栏状.培养细胞经SABC免疫组织化学鉴定.取4~12代于对数生长期的细胞用于实验. 
      
  1.2.4 反义c-myc寡核苷酸导入细胞的证实  按1×107 ?L-1 接种细胞,48h后导入FITC标记的反义c-myc寡核苷酸(2mg?L-1 ),继续培养9h,弃培养液,PBS漂洗2次,每次5min,荧光显微镜下观察反义c-myc寡核苷酸进入细胞内情况. 
      
  1.2.5 反义c-myc寡核苷酸与Lipofectin不同比例的实验观察  实验步骤如上,分别观察反义c-myc寡核苷酸与Lipofctin的质量比为2∶0,2∶1,2∶5,2∶10及2∶20时的转染效果,确定后续实验二者最佳比例. 
      
  1.2.6 反义c-myc寡核苷酸对大鼠ASMC增殖抑制实验  2.5g?L-1 胰酶消化于对数期生长的ASMC,调整细胞数为5×107 ?L-1 ,每孔接种100μL,每4孔为1组,MTT法观察1,2和3mg?L-1 的反义c-myc寡核苷酸对大鼠ASMC的增殖抑制作用1~6d. 
      
  1.2.7 反义c-myc寡核苷酸抑制ASMC c-myc mR-NA表达的实验  以2mg?L-1 的反义c-myc寡核苷酸处理100mL培养瓶中于对数期生长的ASMC72h,1mL TRIZOL匀质化,加入0.2mL三氯甲烷,震摇数秒后于4℃12000g离心15min,上清液加入0.5mL异丙醇沉淀RNA,4℃,12000g离心10min,1mL750mL?L-1 乙醇洗涤RNA沉淀1次,4℃,7500g离心5min,室温下挥发乙醇,50μL无核酶水溶解总RNA;RT-PCR反应系统如下:总RNA1μL,AMV/Tfl反应缓冲液10μL,dNTP(10mmol?L-1 )1μL,引物各1μL,25mmol?L-1 MgSO4 2μL,AMV反转录酶(83.4mkat?L-1 )1μL,Tfl DNA聚合酶(83.4mkat?L-1 )1μL,总体积50μL.引物序列如下:5’TAC TCA CCA GCACAA TTA TG3’,5’TTG AAC GGA CAG GAT GTA GG3’,扩增产物315bp,PCR内参照选用大鼠β-actin,引物序列如下:5’GCC ATT CTC ACC GGA TTC AGT CGT C3’,5’AGC CGC CGT CCC GTC AAG TCA G3’,扩增产物323bp.扩增程序如下:48℃45min反转录,94℃2min,AMV反转录酶失活,RNA/cDNA链打开,94℃变性30s,60℃退火1min,68℃延伸2min,共30循环,末次循环68℃延伸7min.PCR产物经20g?L-1 琼脂糖凝胶电泳检测. 
      
  1.2.8 反义c-myc寡核苷酸抑制ASMC c-Myc蛋白表达的实验  反义c-myc寡核苷酸(2mg?L-1 )处理于对数期生长的ASMC72h,细胞爬片经2次PBS洗涤,950mL?L-1 乙醇固定10min,标准SABC法行免疫组织化学染色:PBS漂洗2次,每次5min;入7.5mL?L-1 H2 O2 -PBS37℃,30min,阻断内源性过氧化物酶;PBS漂洗2次,每次5min;滴加正常山羊血清,37℃保温30min,消除非特异染色;弃封闭血清后加兔抗鼠c-Myc(工作浓度1∶200),37℃保温50min;PBS漂洗3次,每次3min;加生物素化山羊抗兔IgG(工作浓度1∶200),37℃保温30min;PBS漂洗3次,每次3min;加入ABC复合物,37℃保温30min;PBS漂洗3次,每次3min;DAB显色10min,水洗5min,苏木精复染,逐级脱水、透明、封片.以正常兔血清和磷酸盐缓冲液分别代替一抗和二抗,行替代对照和空白对照. 
     
  统计学处理:数据经SPSS软件分析,组间比较采用单因素ANOVA检验. 
      
  2 结果 
      
  2.1 大鼠ASMC的鉴定  大鼠ASMC actin染色结果如Fig1所示.actin主要分布于细胞质内.
      
  2.2 反义c┐myc寡核苷酸导入细胞的证实  经FITC标记的反义c-myc寡核苷酸与平滑肌细胞共培养9h后,细胞核有明亮的荧光染色,部分细胞核核仁染色突出,细胞质亦有染色(Fig2).
2.3 反义c┐myc寡核苷酸与Lipofectin不同比例的实验观察  当反义c-myc寡核苷酸与Lipofctin的质量比为2∶0时,细胞质染色较重,当反义c-myc寡核苷酸与Lipofctin的质量比为2∶1时,细胞核染色渐加重,二者比例为2∶5时细胞核染色最好,当二者比例大于2∶10时,死亡细胞数增加较多. 
      
  2.4 反义c┐myc寡核苷酸对大鼠ASMC的增殖抑制作用  导入1,2和3mg?L-1 的反义c-myc寡核苷酸对ASMC细胞均有抑制作用,这种抑制作用随反义寡核苷酸的浓度增加而增强(Fig3). 2.5 反义c┐myc寡核苷酸抑制ASMC c┐myc mRNA的表达  2mg?L-1 的反义c-myc寡核苷酸处理 
ASMC72h后,c-myc mRNA表达量明显减少(Fig4). 
      
  图1 - 图4 略 
       
  2.6 反义c┐myc寡核苷酸抑制ASM c┐Myc蛋白表达  反义c-myc寡核苷酸导入平滑肌细胞72h后,c-Myc表达量显著下降(Fig5). 
      
  3 讨论 
      
  哮喘反复发作可致气道重塑,多种炎症介质在此过程中发挥作用[1,2] ,其中包括表皮生长因子、转化生长因子、白细胞介素-4,5(interleukin-4,5,IL-4,5)等.原癌基因是这些炎症因子mRNA转录前必须转录的早期基因,是信号转导过程中的最后共同通道[3] .c-Myc是启动细胞周期、促使细胞分裂的重要核转录因子[4] ,c-Myc上存在DNA结合序列CACGTG[5] .几乎所有增殖的细胞都有c-myc表达,静止细胞表达较低,快速增殖细胞表达程度较高.c-Myc蛋白的过量产生,可使一些细胞对生长因子的依赖性减少,导致细胞永生化并失去分化功能[6] . 
     
  反义技术依据核酸杂交原理,使反义核酸与特定基因杂交,在基因水平干扰致病蛋白的生产.本实验将FITC标记的反义c-myc寡核苷酸导入大鼠ASMC,细胞核染色较深,核仁染色明亮,说明反义c-myc寡核苷酸确实进入细胞核内并与核内核酸结合.Lipofectin增加了细胞对反义c-myc寡核苷酸的摄取,硫代修饰的反义c-myc增强了寡核苷酸的稳定性[7] .实验发现反义c-myc寡核苷酸可以抑制大鼠ASMC增殖,且这种抑制作用从反义c-myc寡核苷酸导入细胞的第1日开始就表现的较为明显,并持续到第7日.同时,我们发现反义c-myc寡核苷酸的这种抑制作用具有浓度依赖性,随浓度的增加,抑制作用明显增加.RT-PCR结果显示反义c-myc寡核苷酸可减低细胞内c-myc mRNA的表达,对照组、错配组及正义组寡核苷酸均无此作用,表明反义c-myc寡核苷酸抑制c-myc mRNA的表达具有特异性.免疫组织化学染色显示,在c-myc mRNA的表达减少的同时,c-Myc蛋白的表达量也同时降低,这与张浩等[8] 的研究结果相同.反义c-myc寡核苷酸抑制细胞增殖的可能机制是反义c-myc寡核苷酸封闭了c-myc mRNA的翻译起始部位.本实验设计的反义c-myc寡核苷酸包含AUG结构,这一设计使c-myc mRNA的翻译明显降低,从而降低了与Max蛋白的结合量,继而降低了与DNA序列CACGTG的结合,减少了细胞内多种细胞周期蛋白的表达[9] .RT-PCR结果从另一方面支持了这一理论.反义c-myc寡核苷酸抑制细胞增殖的另一机制是其激活了细胞内RNA酶(如Rnase H等),从而加速mRNA降解,降低c-Myc蛋白的表达.免疫组织化学染色研究显示,反义c-myc寡核苷酸导入细胞内72h后,c-Myc表达明显降低,说明了这一假说的可能性,但反义c-myc寡核苷酸抑制细胞增殖的详细机制仍待进一步研究. 
          
  图5 略     
        
  反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠ASMC增殖,抑制c-myc mRNA的翻译及表达,虽然其详细作用机制还不明了,但它已表现出一定的临床应用前景[10] ,可能为延缓支气管哮喘患者气道重塑提供一种新的疗法.  
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