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lican8341的博客

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HBV源性MicroRNA前体分子预测  

2016-07-04 21:34:36|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 预测HBV基因编码的microRNA分子前体. 方法: 采用VMir软件,对HBV全基因进行扫描,通过对所得序列的评分及结构分析,得到HBV编码的microRNA的候选前体分子;通过Northern blot实验,对预测结果进行初步验证. 结果: 通过VMir的预测,得到3个HBV可能编码的microRNA分子前体,即MD6,MD20,MR31;通过Northern blot实验,只有针对于MD17的探针杂交后出现特异性条带. 结论: MD17可能为HBV基因组编码的microRNA前体分子.  
【关键词】  肝炎病素 乙型 微RNAs 预测

    0引言 
      MicroRNA是一类21~23 nt长的非编码单链小分子RNA,是由priRNA分子经过剪切成为70~90个碱基大小、具有发卡结构单链RNA的前体(premiRNA),再经Dicer酶加工生成[1]. MicroRNA广泛存在于真核生物中,迄今为止在人体中已经发现了至少320种MicroRNA分子. MicroRNA通过与mRNA的3′非编码区相互作用调控基因表达,在机体的生理及病理过程中发挥重要作用. 最近研究表明,一些病毒的基因组,如疱疹病毒、腺病毒、HIV,也能编码MicroRNA[2]. HBV基因组能否编码MicroRNA分子目前还不清楚. 本研究中,我们借助于预测软件VMir,对HBV全基因组进行正反两个方向的扫描,寻找HBV基因中编码microRNA前体分子,对HBV编码的microRNA分子进行初步预测,并通过Northern blot实验对其进行初步鉴定. 
    1材料和方法 
    1.1材料预测软件VMir由加利福尼亚大学Grundhoff AT教授惠赠. HBV全基因序列检索自Genebank,序列号为NC_003977,adr型. HepG2和HepG2.2.15细胞均购自ATCC. HepG2细胞培养选用含100 mL/L胎牛血清(Hyclone)RPMI 1640培养液(Gibco). HepG2.2.15细胞选用含相同血清浓度的培养液,另外加入终浓度380  mg/L的G418 (Sigma). 上述两种细胞均在37℃的含50 mL/L  CO2孵箱中培养. Trizol购自Invitrogen公司. Northen blot所用尼龙膜购自Ambion公司. [γ32P] ATP购自北京福瑞生物工程公司. 
    1.2方法 
    1.2.1预测软件VMir工作原理VMir是由Grundhoff AT等[3-4]创建的一种病毒编码MicroRNA前体分子预测方法. 工作原理为:病毒基因序列以500 nt为一个窗口,10 nt递进扫描;RNAfold算法预测窗口内的发卡结构;限定发卡结构长度,按照以下规则评分:每个互补的碱基对奖励2分;末端环状结构超过17个碱基时,每超一个,减1分;对于对称性隆起,减去碱基数×1(碱基数≤4)或碱基数×1.5(碱基数﹥4) ;对于非对称性隆起,减去碱基数×2. 经上述处理,每个发卡结构得到一基数,再乘以系数Ip得到最终分值. 再进一步限定分值及其窗口出现频率(一般限定最低分值为115,窗口值即在不同窗口中出现的频率为35,因在该条件下成功预测概率为98%[4]),最终得到病毒基因编码的microRNA前体分子. 该方法已经成功预测出KSHV(卡普西肉瘤相关病毒)、EBV(EB病毒)等编码的microRNA前体分子. 
    1.2.2利用VMir预测HBV编码的microRNA前体分子将HBV全基因序列(NC_003977)导入VMir软件,设定窗口大小为500 nt,递进单位为10 nt,发卡结构长度设为100 nt,对HBV基因组中能够形成发卡结构的序列进行初筛. 然后,设定以每个序列最低得分为115,其窗口值最低为35,得到HBV可能编码的microRNA前体分子. 
    1.2.3预测前体分子的初步验证我们选用Northern blot方法对经VMir软件筛选到的候选分子进行初步验证. 所用探针序列为候选microRNA分子的反相互补序列,用T4多聚核苷酸激酶末端标记放射性标记γ32P. 以稳定表达HBV的HepG2.2.15为研究对象,以HepG2细胞作为对照,按照试剂说明书,利用Trizol试剂提取总RNA. 取40 μg总RNA进行150 g/L  TBE尿素凝胶电泳;再经半干转运至尼龙膜后,利用上述标记探针杂交、放射自显影. 如果经VMir预测到的候选分子是HBV基因编码的microRNA前体分子,那么来自于HepG2.2.15细胞的总RNA与探针杂交后,应出现两条特异性的条带:分子量较大的一条为microRNA前体分子,较小的一条为成熟的microRNA分子. 因为microRNA前体分子在Dicer酶作用下产生成熟的microRNA分子,而剩余的核苷酸将迅速被降解,故一般只有两条特异性条带. 而来源于HepG2细胞的总RNA与探针杂交后则没有特异性条带产生. 
    2结果 
    2.1HBV基因组中microRNA前体分子预测将HBV基因序列导入VMir软件后,设定窗口大小为500 nt,以10 nt为递进单位,寻找HBV基因中的发卡结构序列. 共查找到56个寡核苷酸分子,其中在正向序列中有25条(MD1~25),反向序列31条(MR1~31). 然后分别设定窗口值和最低分值为35和115,筛选出HBV最有可能编码的microRNA分子前体序列,最终得到了三个候选分子,即MD6, MD17和MR31(表1). 上述3个序列经RNAfold程序分析,得到二级结构(图1),表明这三条序列能形成典型的发卡样结构. 总之,从这三条序列的评分、窗口值及其二级结构,都提示他们可能是HBV基因组编码的microRNA前体分子;提示HBV同EBV, KSHV相似,也可能编制病毒来源的microRNA分子. 表1 HBV基因组中的候选 
    2.2microRNA前体分子的初步验证为了进一步证实MD6,MD17和MR31三个候选分子是否为HBV基因组编码的microRNA前体分子. 我们分别以MD6, MD17和MR31的反向互补的核苷酸序列,即TGGTAATAGAG GTAAAAAGGGACTCAAGATGTTGTACAGACTTGGCCCCCAATACCACATCATCCA,TCAA TGTCCATGCCCCAAAGCCACCCAAGGCACAGCTTGGAGGCTTGAACAGTAGGACATGAA CATGA和CCTCCTTTCCTCACATTCATTTACAGGAGGACATTATTAATAGATGTCAACAAT ATGTGGGCCCTCTGACAGTTAATGAAAAAAGGAGA作为探针,末端标记γ32P放射标记,分别HepG2细胞和稳定表达HBV病毒颗粒HepG2.2.15细胞的总RNA为杂交模板进行Northern blot实验.  HepG2.2.15细胞总RNA只有与MD17互补的探针杂交后产生两条特异性的条带(图1C),而与MD6(图1A)和MR31(图1B)互补的探针杂交则没有特异性条带产生. 因此,提示MD17(TCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGC TGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGCATGGACATTGA)可能为HBV基因编码的miroRNA前体分子. 
    3讨论 
      microRNAs是一类非编码的小RNA分子,长度约为21~23 nt. 已经被鉴定的microRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的,有5′端磷酸基和3′羟基,定位于RNA前体的3′端或者5′端. 自从第一个miRNA (lin4和let7)分子在线虫中发现[5],迄今为止在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出的microRNA数量已超过3500个[6]. microRNA通过与mRNA的3′非编码区的相互作用,参与基因的表达调控,在人类基因中至少有1/3受microRNAs调控,在生理和病理过程中均具有重要作用[7-8].

同其人类、果蝇、植物等多种生物物种一样,许多类似于HBV的DNA病毒也能编码病毒基因组来源microRNAs,如疱疹病毒家族的非洲淋巴细胞瘤病毒、卡波济肉瘤相关疱疹病毒、人巨细胞病毒,多瘤病毒属的肉瘤病毒40、鼠多瘤病毒,均能编码病毒特异性的microRNAs分子;这些病毒编码的microRNAs分子通过调控宿主细胞中或病毒本身特定基因的表达,使宿主细胞内环境的有利于病毒的复制、传播,有利于病毒逃逸宿主的免疫系统,最终达到保护自己的目的[9-10]. 
      鉴于病毒编码的microRNAs在病毒生活周期中的重要意义,在某种程度上我们可以推测,HBV作为一种常见的影响人类健康的致病病毒,也可能编码自己的microRNAs分子. VMir是由Grundhoff AT等研发的一种用来预测病毒编码microRNAs的软件,他们已经通过大量实验证实该软件可以有效地预测病毒编码的microRNA前体分子,进而达到预测病毒编码microRNA分子的目的. 我们借助该预测软件,对HBV的基因进行扫描,以期得到HBV编码的microRNA前体分子. 经过筛选,最终我们得到了3条候选核苷酸序列,即MD6, MD17和MR31. 这3条寡核苷酸分子无论从其评分还是结构都符合microRNA前体分子的条件. 然后,我们分别以MD6,MD17和MR31的反向互补序列为探针,与HepG2.2.15细胞的总RNA杂交,以HepG2细胞的总RNA为阴性对照,进行Northern Blot实验. 结果提示,只有MD17特异性探针有两条特异性条带产生,因此提示MD17很有可能就是HBV编码microRNAs的前体分子. 在后续的实验中,我们将通过Northern blot, RNA酶保护实验等手段来进一步验证MD17分子,并在此基础上找到其编码的成熟microRNAs分子. 

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