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日志

 
 

人热休克蛋白72基因的克隆、原核表达与纯化  

2016-07-04 21:50:07|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【关键词】  肝肿瘤 
    关键词: 肝肿瘤;细胞株;热休克蛋白72;克隆;基因表达  
    摘 要:目的  克隆人热休克蛋白72(HSP72)基因,原核表达并纯化蛋白产物,以探讨其生物学功能. 方法  从热休克的人肝癌细胞株SMMC-7721中,用RT-PCR方法扩增得到HSP72基因并克隆到原核表达载体pQE-30中,在大肠杆菌JM109中用IPTG诱导下表达的蛋白经FPLC梯度洗脱和Sephacryl S200凝胶过滤纯化,经SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上,用anti-HSP72单抗作探针,进行Western blot鉴定. 结果  克隆的基因序列分析结果与有关报道一致,所构建的pQE-30HSP72载体在大肠杆菌中表达出与预期大小相符的Mr 为72000的蛋白,经鉴定确系HSP72蛋白. 结论  克隆了人HSP72基因,并对该基因进行了原核表达与纯化,为进一步研究其生物学功能奠定了良好基础. 
  Keywords:liver neoplasms;cell line;heat shock protein72;cloning;gene expression 
      
  Abstract:AIM To clone human heat shock protein72(HSP72)gene,do prokaryotic expression and purify HSP72protein for further study.METHODS Human HSP72gene was obtained by RT-PCR from heat shocked human hepato-carcinoma cell line SMMC-7721.Its product was recombined in vitro with prokaryotic expression vector pQE-30and was transformed to E.coli strain JM109.The proteins,expressed in E.coli strain with HSP72recombinant plasmid under IPTG induction,was obtained by FPLC and Sephacryl S200chro-matography and characterized by SDS-PAGE and Western-blot-confirmed with anti-HSP72McAb.RESULTS The HSP72gene was cloned and identified to be consistent with relevant reports.The HSP72with a molecular weight of72000was highly expressed in pQE-30HSP72.Western blot proved that the expressed product had the antigenicity of HSP72.CONCLUSION The establishment of a series of methods for the cloning,expression and purification of HSP72gene will assist in the structural and functional char-acterization of HSP72. 
      
  0 引言 
      
  热休克蛋白(HSP)是生物体(或离体的培养细胞)在不良环境因素作用下(如缺血、缺氧、重金属离子、氨基酸类似物、病毒感染、DNA损伤等)所产生的一组特殊蛋白质,对细胞损伤有保护作用.其生物学功能很广泛,在细胞生长、发育、分化过程中参与基因转录、蛋白质合成、折叠、跨膜运输、分解和立体构象的维持并发挥重要作用,属分子伴侣蛋白[1] .热休克蛋白72(HSP72)是HSP中最保守和最主要的一类.近年来发现很多疾病的发生、发展均与其有关,有必要进一步了解其生物学功能.我们克隆了人HSP72基因,并在大肠杆菌内对该基因进行了诱导表达,建立了一套完备的纯化方法,为进一步研究提供了条件. 
      
  1 材料和方法 
      
  1.1 材料  人肝癌细胞株SMMC-7721和受体菌JM109由本室保存.测序质粒载体pUC19和原核表达质粒pQE-30由中山医科大学叶苓博士惠赠.EcoR I,Pst I,T4DNA连接酶、Taq DNA聚合酶购自NSBC Sangon公司.DNA Marker、蛋白质相对分子质量标准和anti-HSP72单抗购自Gibco公司.IPTG、细胞总RNA提取试剂盒和质粒提取纯化试剂盒为Promega公司产品.cDNA第一链合成试剂盒购于华美生物公司.  
  1.2 方法 
      
  1.2.1 PCR引物的设计  根据GeneBank中已报道的人HSP72基因序列,设计了一对PCR扩增引物,并在片段的5’及3’端序列引入HSP72基因内部没有的新的酶切位点EcoR I和Pst I以便于基因的酶切和定向克隆.P1:5’cggattcATGGCCAAAGC-CGCGGCG3’;P2:5’cgctcgagATCTACCTCCT-CAATGGT3’. 
      
  1.2.2 人HSP72基因的扩增  人肝癌细胞株SMMC-7721经42℃热休克2h,于休克后16h[2] 根据试剂盒说明提取细胞总RNA,反转录合成cDNA第一链,以其为模板PCR扩增HSP72目的片段.反应条件:去离子水37μL,cDNA1μL,引物各1μL,10×buffer5μL,25mmol?L-1 dNTP1μL,10mmol?L-1 MgCl2 3μL,混匀,94℃变性5min,冰浴1min后,加入Taq DNA聚合酶1μL.PCR仪扩增,反应参数:先95℃预变性5min,然后按94℃1min,55℃1min,72℃2min的条件进行35个循环,最后72℃延伸10min. 
      
  1.2.3 HSP72基因的克隆与测序  经PCR扩增后,扩增产物在10g?L-1 琼脂糖凝胶上电泳鉴定.将质粒pUC19和目的片段经EcoR I和Pst I双酶切,回收载体和目的片段,在T4DNA连接酶作用下12℃过夜,连接产物转化大肠杆菌JM109,挑选阳性克隆,经质粒提取、酶切分析和PCR扩增鉴定后行全基因的全自动序列分析. 
      
  1.2.4 HSP72基因的原核表达  从经测序鉴定后的pUC19-HSP72中EcoR I和Pst I双酶切回收HSP72目的基因片段,并与经同样限制酶双酶切的原核表达质粒pQE-30相连接,建立原核表达载体pQE-30HSP72,转化大肠杆菌JM109,挑选阳性克隆,经质粒提取、酶切鉴定后将含有表达载体的单一菌落在LB培养基(含100mg?L-1 氨苄青霉素)中过夜培养,然后转接至新的10g?L-1 LB肉汤管(含2g?L-1 葡萄糖、100mg?L-1 氨苄青霉素)中,继续培养至A值约为0.4~0.6,37℃加诱导剂IPTG至终浓度为1mmol?L-1 ,取诱导0,0.5,1,2,3和4h各组样品,SDS-PAGE检测表达产物,并用anti-HSP72单抗作Western blot鉴定其抗原性[3] . 
      
  1.2.5 HSP72蛋白的纯化和鉴定  pQE-30HSP72转化的JM109菌经培养和IPTG诱导表达后,12000g离心5min收集沉淀、经30mmol?L-1 NaHCO3 
(pH7.4)溶液4℃低渗30min,12000g离心15min 取上清,PEG20000浓缩后过FPLC离子交换柱[4] ,梯度洗脱,收集峰值蛋白液;浓缩后分别过Sephacryl S200凝胶柱,收集峰值蛋白液;纯化蛋白液分别用SDS-PAGE检测相对分子质量,并用anti-HSP72单抗作探针,进行Western blot鉴定其抗原性. 
      
  2 结果 
      
  2.1 人HSP72基因的克隆与测序  经PCR扩增后,扩增产物在10g?L-1 琼脂糖凝胶上电泳鉴定结果表明,从人肝癌细胞株SMMC-7721扩增得到了长度约1.9kb的DNA片段(Fig1).克隆基因的全自动序列分析结果与GeneBank所报道的人HSP72基因序列相一致. 
     
  图1 重组pQE-30HSP72载体DNA酶切后电泳图 略    
      
  2.2 重组原核表达载体的构建与鉴定  重组原核表达载体pQE-30HSP72转化大肠杆菌JM109后,经质粒提取和10g?L-1 琼脂糖凝胶电泳检测结果显示,用EcoR I酶切的A组,在5400bp处有一条带,经EcoR I和Pst I双酶切的B组,在1900bp处和3500bp处各有一条带(Fig1).
2.3 pQE┐30HSP72表达产物的检测  重组pQE-30HSP72转化的大肠杆菌JM109,用IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE检测对照、实验组0h均无明显表达,实验组0.5,1,2,3和4h各组可见在Mr 72000处有一蛋白带,随时间延长表达产物增多,2h时最多(Fig2).用Western blot法检测抗原可见在Mr 72000处有一与anti-HSP72单抗结合带,随时间延长而加深. 
      
  2.4 纯化蛋白的鉴定  经FPLC梯度洗脱和Sephacryl S200凝胶过滤纯化的蛋白,经SDS-PAGE检测在Mr 72000处有一条带,用anti-HSP72单抗行Western blot鉴定在Mr 72000处有一抗体结合带(Fig3). 
    图2 - 图3 略 
      
  3 讨论 
      
  HSP72是HSP70家族的主要成员,是热休克蛋白73(HSP73)的类似蛋白,HSP73主要呈结构性表达于几乎所有细胞,而在哺乳动物中正常情况下很难测出HSP72,但在应激反应状态下HSP72会大量合成[5] .两者不仅相对分子质量相似,其结构、功能及生物学特性也相似.此外,HSP72还具有HSP73所不具有的、尤其是与应激相关的一些功能,如在变性蛋白聚集体的折叠及溶解过程中的“分子伴侣”作用,参与应激时产生的不可逆变性蛋白的转位等[6] .尽管对HSP72的研究一直很热门,对其作用机制仍知之甚少.现已知HSP72有两个结构域:N末端有一 腺苷酸结合区,具有微弱的ATP酶活性,C末端存在基质识别区,可与短的多肽非共价结合[7] .近年来发现HSP72蛋白与自身免疫性疾病、缺血性疾病、癫痫及各类肿瘤等疾病有密切联系[8] ,因而,对其做深入研究很有必要.我们所用pQE-30是含有T7启动子、终止子和抗Amp基因等的高表达原核载体.HSP72基因全长约1900bp,重组的基因图长约5400bp.JM109菌株是Amp(―)菌株,当重组载体转入后,由于含有抗Amp基因,转化的细菌就能在Amp(+)的琼脂平板上生长.从转化菌中提取的质粒,经单独酶切得到的5400bp基因片段与重组载体长度一致,经双酶切得到的3500bp片段为pQE-30的基因,另一1900bp基因片段为人HSP72基因,因此重组载体的构建与设想一致. 
     
  本结果显示,转化菌株在IPTG的诱导下能产生Mr 为72000的蛋白,且随时间延长表达产物明显增多.用anti-HSP72单抗Western blot法检测证明,该蛋白具有HSP72抗原特异性,因而该转化菌株表达产物为HSP72.而转入pQE-30的对照组无明显表达Mr 70000的蛋白,也不随诱导时间延长而变化.取诱导2h后的细菌低渗裂解液,经FPLC分离后共获8个蛋白洗脱峰,其中第3,5峰洗脱液中富含HSP72蛋白,但尚含有较多的Mr <60000的其他蛋白,此两峰蛋白样品经Sephacryl S200进一步分离,电泳结果表明,获得纯度较高的M r 为70000的目的蛋白Western blot进一步证实为HSP72.为进一步研究HSP72的结构和功能及临床应用奠定了基础. 
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