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lican8341的博客

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日志

 
 

死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化特异性PCR法的建立与初步应用  

2017-02-17 22:01:36|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 建立甲基化特异性PCR(MSP)技术检测死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子甲基化。方法: 设计针对DAPK基因启动子的MSP引物,建立MSP检测体系对甲基化阳性模板进行检测,评价其特异性、重复性和灵敏性,并经测序鉴定。结果: 所建立的甲基化MSP方法仅能扩增出甲基化阳性模板,不能扩增出未甲基化阳性模板和未硫化处理的DNA模板;对不同梯度稀释的甲基化阳性模板进行检测,其最大敏感性可达2%;在不同时间进行甲基化MSP检测的结果均一致。结论: 成功建立的DAPK基因启动子甲基化MSP检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,可用于肿瘤标本的批量检测。

【关键词】  死亡相关蛋白激酶; 甲基化特异性PCR; 甲基化

    [Abstract]  Objective: To establish the methylationspecific PCR(MSP) for the detection of promoter methylation of deathassociated protein kinase(DAPK) gene.Methods: The primers of MSP aiming at the DAPK promoter were designed.MSP was established to detect the methylation positive DNA templates.The specificity, sensibility and repeatability were evaluated. Results: The established methylated MSP could only amplify the methylation positive DNA template, but not the unmethylated DNA template and unmodified DNA template.In a series of dilution, methylated MSP could detect 2% methylation positive DNA templates.The amplified results of same sample were identical on different time. Conclusion: The methylated MSP technique for detecting of DAPK methylation was established successfully and can be used for analyzing samples from cancer patients.

    [Key words]  deathassociated protein kinase;  methylationspecific PCR;  methylation

    死亡相关蛋白激酶(deathassociated protein kinase, DAPK)是一种相对分子质量为160 kDa的钙调蛋白依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,DAPK是一种正性细胞凋亡调节因子,作为抑癌基因通过多种途径诱导肿瘤细胞凋亡,动物模型研究发现DAPK能够在肿瘤发育的早期阶段抑制细胞转化、并且能够抑制晚期转移事件[1]。近年来对造血系统肿瘤的研究揭示伯基特淋巴瘤(BL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫大B细胞性淋巴瘤(DLBCL)[2,3]、急性髓细胞白血病(AML)、骨髓增生异常综合征(MDS)[4]、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)[5]同样存在着较高频率的DAPK基因启动子甲基化。此外,研究发现DAPK基因启动子异常甲基化与消化道、泌尿道、头颈部、呼吸道肿瘤的发生发展密切相关。为此我们建立了甲基化MSP技术对DAPK基因启动子甲基化进行检测,证实其具有良好的重复性、敏感性和特异性,可用于临床肿瘤标本的批量检测。

    1  材料和方法

    1.1  材  料

    1.1.1  研究对象  5例正常人DNA来自我院体检正常人的外周血,5例正常骨髓取自血象正常的胸外科良性肿瘤患者的肋骨骨髓,10例MM患者骨髓来自我院血液科住院患者;甲基化和未甲基化阳性对照分别为经CpG甲基转移酶(M.SssI)处理后再行重硫酸盐修饰的正常人外周血DNA和不经M.SssI处理直接行重硫酸盐修饰的正常人外周血DNA,去离子水作为阴性对照。

    1.1.2  主要试剂  基因组DNA 提取试剂盒(Gentra公司);DNA 修饰试剂盒(Chemicon公司);热启动酶(Takara公司);PGEMT克隆载体、T4 DNA连接酶(Promega公司);AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒、AxyPrep质粒DNA试剂盒(Axygen公司); PCR引物均由上海基康生物工程技术服务有限公司合成。

    1.1.3  主要仪器  PE9600 PCR仪(ABI公司,美国);iCycler梯度PCR仪(伯乐公司,美国); Gene Genius凝胶成像仪(Syngene公司,英国)。

    1.2  方  法

    1.2.1  单个核细胞分离和基因组DNA制备  正常人外周血、肋骨骨髓及MM患者骨髓单个核细胞提取按常规进行;基因组DNA 提取按试剂盒说明书操作,经核酸定量仪定量后-20℃保存备用。

    1.2.2  DNA亚硫酸氢盐修饰   取1  μg DNA标本按DNA修饰试剂盒的操作步骤进行亚硫酸氢盐修饰,-20℃保存备用。

    1.2.3  DAPK基因启动子MSP检测  参照文献[10]合成DAPK基因甲基化(M)引物序列和未甲基化(U)引物序列(表1)。热启动PCR反应体系为25  μl,包括10×PCR 缓冲液, 2.5 mmol/L MgCl2, 2.5 mmol/L dNTP, 1 U 热启动Taq DNA酶(Takara公司,日本)及修饰后的样本DNA 2 μl。反应条件经梯度PCR仪优化,为95℃ 预变性5 min, 然后94℃ 30 s。M和U的退火条件分别为 61℃ 30 s;60℃ 30 s,72℃延伸30 s,扩增40个循环, 72℃延伸7 min。扩增产物在2%琼脂糖凝胶上采用100 V电压电泳1 h, 在Gene Genius凝胶成像仪下观察电泳结果。表1  DAPK甲基化(M)和未甲基化(U)引物序列

    1.2.4  PCR产物克隆测序  采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化,将其克隆入pGEMT克隆载体,对感受态大肠埃希菌DH5α进行转化和蓝白斑筛选,挑选白色菌落进行PCR扩增鉴定,将PCR扩增为阳性结果的甲基化和未甲基化产物送上海基康生物技术有限公司测序。

    1.2.5  特异性检测  应用甲基化MSP反应体系分别对M.SssI处理后再硫化修饰、不经过M.SssI处理直接硫化修饰和未经硫化修饰的正常人外周血DNA标本、正常肋骨DNA及双蒸水进行检测。

    1.2.6  重复性检测  对1例正常人外周血DNA标本行M.SssI处理后分装,将其在同一批次甲基化MSP检测中重复3次,2%琼脂糖凝胶并拍照;将剩余的阳性DNA -20℃冻存,每3天进行一次甲基化MSP检测,2%琼脂糖凝胶并拍照,比较1个月中条带亮度是否有明显变化。

    1.2.7  敏感性检测  取80 ng经M.SssI处理后再硫化修饰的正常人外周血DNA,应用不经过M.SssI处理直接硫化修饰的正常人外周血DNA梯度稀释后进行甲基化MSP检测。

    1.2.8  标本MSP检测  用甲基化MSP和未甲基化MSP技术分别检测5例正常肋骨和10例MM患者硫化修饰后的DNA。

 2  结  果

    2.1  MSP的特异性 

    只有经M.SssI处理后再硫化修饰的DNA标本出现DAPK甲基化阳性条带,而不经过M.SssI处理直接硫化修饰以及未经硫化修饰的DNA标本、双蒸水均为阴性(图1)。

    1~5:不同浓度甲基化阳性模板的MSP扩增结果(分别为100%,20%,4%,2%和0%甲基化阳性DNA模板); 6:甲基化MSP扩增未硫化修饰的DNA; 7:ddH2O空白对照;M:标准参照物

    2.2  重复性 

    同一批次甲基化MSP检测中3次结果及每3天对冻存标本进行一次甲基化MSP检测的重复性良好,1个月中条带亮度无明显变化。

    2.3  敏感性 

    甲基化阳性对照用未甲基化阳性对照进行梯度稀释后,DAPK甲基化检测的最大检测灵敏度达1∶50(2%)。

    2.4  测序结果

    甲基化和未甲基化产物测序结果见图2。未甲基化产物中的胞嘧啶全部转变为胸腺嘧啶;甲基化产物所有CpG对应的胞嘧啶均保持不变,而CpG二核苷酸以外的胞嘧啶都转变为胸腺嘧啶。

    2.5  标本MSP检测结果  

    甲基化MSP检测显示5例正常肋骨DNA均为DAPK甲基化阴性, 10例多发性骨髓瘤(MM)中有6例出现DAPK甲基化阳性条带;未甲基化MSP检测揭示5例正常肋骨和10例MM患者骨髓标本均为阳性。

    3  讨  论

    近20年来,DNA甲基化的生理和病理意义已得到广泛研究,尤其是在肿瘤的早期诊断、分类、分级及预后评估中的潜在重要价值已成为近年来的一个研究热点。一系列DNA甲基化检测技术不断问世,包括从基因组整体水平的甲基化态势检测如差异甲基化杂交(DMH)、染色质免疫共沉淀-芯片技术(CHIPchip)等[7]以及特异位点甲基化的检测如MSP、结合重硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)等,此外,还有通过公式计算所得甲基化水平的报道[8]。

    MSP技术是Herman等[9]于1996年在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法,它将DNA先用重亚硫酸盐处理,这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则不变,随后进行PCR扩增。MSP中设计两对引物,分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对,即一对结合处理后的甲基化DNA链,另一对结合处理后的未甲基化DNA链。检测MSP扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段,则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的未甲基化DNA链的引物扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化。MSP技术自问世以来,由于具有经济、简便、快速、高效的优点,并且所需DNA标本量少,可用于微量标本及石蜡包埋标本的检测,目前已成为基因启动子甲基化检测手段中应用最为广泛的一个技术。但如果MSP引物设计和反应条件不当常会产生假阳性结果[10],我们既往对其他基因的研究也表明甲基化MSP常常会把未甲基化标本扩出,唯有测序才能鉴定。因此各个实验室在建立MSP技术时一定要客观评价其特异性、灵敏性和重复性,必须在这些指标得到确认后才能对临床标本进行检测,否则难以保证批量检测结果的可靠性。

    本研究建立了DAPK启动子甲基化检测的MSP技术,具有良好的特异性、灵敏性和重复性,并且我们对10例MM患者的检测结果发现其中6例为DAPK启动子甲基化阳性,甲基化阳性率为60%,需进一步扩大标本量行甲基化MSP检测,计算甲基化阳性率并分析其与临床的相关性;随机选择1例阳性标本进行测序也证实了结果的可靠性,证实我们所建立的MSP方法可用于肿瘤标本DAPK基因启动子甲基化的批量检测。

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