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日志

 
 

WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究  

2017-02-17 22:16:15|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  本研究探讨WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性,为开展基于WT1基因调控的白血病基因治疗奠定基础。 以EGFP做报告基因,构建含有WT1基因启动子和增强子的重组表达载体;利用脂质体和电穿孔技术将重组质粒转染13个细胞株,包括WT1基因高表达的白血病细胞株(K562、NB4、THP1、SHI1),WT1基因低表达的白血病细胞株(U937和Jurkat);非造血细胞株中WT1基因高表达的MCF7、T47D、293株细胞和WT1基因低表达的ECV304、SMMC7721、HT29、SHG44细胞株;利用流式细胞术检测转基因细胞稳定表达EGFP的平均荧光强度。以平均荧光强度代表启动子和(或)增强子的转录活性。结果表明: 通过基因重组技术构建了含有WT1基因启动子的表达载体pEWP,以及含有WT1基因启动子和增强子的表达载体pEWPA。就启动子的转录活性而言,在非白血病细胞株中,ECV304细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体(pEGFP1)的16.54±2.45倍,明显高于白血病细胞株(p<0.05);MCF7和SHG44细胞次之,分别为9.46±1.10和7.29±0.73倍,HT29细胞表达最低,仅为0.99±0.02倍。在人类血病细胞株中,K562细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体pEGFP1的2.93±0.27倍,明显高于Jurkat和SHI1细胞株(p<0.05)。后二者分别为0.74±0.03和0.84±0.09倍。pEWPA可以使HT29、SHI1和K562细胞中WT1基因启动子的转录活性增强,分别增强到4.81、3.06和1.01倍。结论: WT1基因启动子的转录活性与细胞内在WT1基因的表达水平不相关,增强子增强部分细胞株中WT1基因启动子的转录活性,但不具有造血组织特异性。

【关键词】  平均荧光强度

    Transcriptional Activity of WT1 Gene Promoter and Enhancer in  Diverse  Cell Lines

        Abstract    The objective of study was to  investigate tissuespecific transcriptional activity of WT1 (Wilms' tumor gene) promoter and enhancer in cell lines with diverse tissue origin for leukemic gene therapy depending on WT1 transcriptional regulation elements.  WT1 promoter and enhancer were ligated into pEGFP1 to construct a recombinant vectors with EGFP gene as a reporter. By using electroporation or lipofectamine, the resultant constructs were transfected into 13 cell lines including WT1expressing hematopoietic cell lines (K562, NB4, THP1 and SHI1), WT1nonexpressing hematopoietic cell lines (U937 and Jurkat), WT1expressing nonhematopoietic cell lines (MCF7, T47D and 293) and WT1nonexpressing nonhematopoietic cell lines (ECV304, SMMC7721, HT29 and SHG44). The mean fluorescence intensity (MFI) of EGFP representing the transcriptional activities of promoter and/or enhancer was analyzed by using flow cytometry in the transfected cells which stably expressed EGFP.  The results indcated that  the vectors, pEWP containing WT1 promoter and pEWPA containing both WT1 enhancer and promoter, were constructed by recombinant DNA technique. Among nonhematopoietic cell lines, pEWP induced the highest EGFP expression in ECV304  (16.54±2.45 times as high as  pEGFP1),  mildly higher in MCF7 and SHG44  (9.46±1.10 and 7.29±0.73 times of  pEGFP1  level), and lowest in HT29  (0.99±0.02 times as much as  pEGFP1) respectively.  Among hematopoietic cell lines, EGFP expression was highest in K562 cell line  (2.93±0.27 times  of pEGFP1), which was statistically higher than those  in Jurkat and SHI1 cell lines (0.74±0.03 and 0.84±0.09 times   of pEGFP1  level)   respectively. pEWPA, with WT1 enhancer inserted at Afl II site near SV40 polyA, increased basal transcription levels of the WT1 promoter in HT29, SHI1 and K562 cells by 4.81, 3.06 and 1.01fold respectively. It is concluded that the transcriptional activities  of WT1 promoter in the recombinant vector seem unrelated to the constitutional expression level of endogenous WT1 gene. The WT1 enhancer   promotes the transcriptional activities of WT1 promoter in some of the cell lines regardless of the hematopoietic tissue origin.

    Key words    WT1 gene; WT1 promoter; WT1 enhancer; mean fluorescence intensity;  leukemic cell line;  hematopoietic tissue specificity

       WT1(Wilms' tumor susceptibility gene)基因是1990年由Call、Bonetta、Gessler等在Wilms'瘤中发现并克隆,定位于11号染色体短臂的1区3带,是一种对泌尿生殖系统的发育和Wilms' 瘤的发生发展有重要意义的基因。近年来的研究发现,WT1基因参与人类造血调控,在人类多种白血病及实体瘤中均有WT1基因的异常高表达。由于白血病患者WT1基因表达水平高,与性别、年龄、FAB分型、乳酸脱氢酶水平及染色体核型等均无关,故被看作是一种"泛白血病"的分子标志[1]。目前以WT1基因为靶点治疗白血病的研究报道很多,基本上是针对WT1基因表达产物的免疫治疗和反义寡核苷酸治疗,尚无基于WT1基因启动子和增强子调控的白血病基因治疗。

      J Exp Hematol 2007; 15(5)WT1基因启动子和增强子在不同细胞株中的转录活性研究根据基因表达调控原理,基因特异性的表达是反式作用因子与顺式作用元件共同作用的结果。而作为顺式作用元件,同一基因的启动子和增强子在不同的组织、细胞中可能会有不同的作用。Fraizer等[2]和Zhang等[3]利用CAT做报告基因,研究WT1基因的转录调控元件,发现WT1基因的启动子无组织特异性,而增强子具有造血组织特异性。Hosen等[4]利用EGFP做报告基因,发现WT1基因的启动子存在多个转录起始位点,WT1基因的增强子在造血细胞中具有协同作用。

    本研究在上述研究的基础上,将转染靶细胞扩大到13种属于不同组织来源的细胞株,通过检测EGFP的平均荧光强度确证WT1基因的启动子和增强子的造血组织特异性,以便开发基于WT1基因启动子和增强子调控的白血病基因治疗途径。

    材料和方法

    主要材料

    携带WT1基因启动子和增强子的质粒pCB.7e250()由美国Fraizer GC博士惠赠; pEGFP1载体购自Becton Dickinson Biosciences公司。大肠杆菌DH5α为本实验室保存。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒为Qiagen公司产品;T4 DNA连接酶和限制性核酸内切酶HindⅢ、PstⅠ、BamH I、SalⅠ、HpaⅠ为MBI公司产品;AflⅡ和StuⅠ为TaKaRa宝生物工程(大连)有限公司产品;小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)为Promega公司产品;Klenow片段为上海华美生物公司产品;PEG8000为上海生工公司产品;蛋白酶K、DNA分子量标准购自MBI公司;卡那霉素、Xgal和IPTG为Sigma公司产品;脂质体为Invitrogen公司产品;Epics XL型流式细胞仪为Coulter公司生产;实时定量PCR试剂购于TaKaRa公司。实时定量PCR仪MJ Research Opticon2TM为MJ公司产品;BDFACS AriaTM为Becton Dickinson公司产品,用于细胞分选。

    重组载体构建

    WT1基因启动子的构建  pCB.7e250()进行HindⅢ/PstⅠ双酶切,将所得到的WT1基因启动子片段克隆到pUC18质粒,经测序证实后再与HindⅢ/PstⅠ双酶切pEGFP1体连接,构建成含有WT1基因启动子的表达载体,即pEWP,进行酶切鉴定。

    WT1增强子的构建  将 pCB.7e250()进行BamHⅠ酶切,所得到的WT1基因增强子片段克隆到pUC18质粒,经测序证实后,进行补平,再与经AflⅡ酶切后补平且去5'磷酸化的pEWP连接,构建成含有WT1基因启动子和增强子的表达载体,即pEWPA,进行酶切鉴定,参见文献[5]。

    细胞培养与转染

    细胞培养  人早幼粒细胞白血病细胞株NB4,慢性粒细胞白血病急性变红白血病细胞株K562,单核细胞白血病细胞株U937,THP1,SHI1,T淋巴细胞性白血病细胞株Jurkat,乳腺癌细胞株MCF7,T47D,人类结肠腺癌细胞株HT29,人类肝癌细胞株SMMC7721,人神经胶质瘤细胞株SHG44,人脐静脉内皮细胞转化细胞株ECV304,人类胚胎肾转化细胞株293细胞株均为本室保存,于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。含15%胎牛血清(FCS)(杭州四季青公司产品)的RPMI 1640(Gibco/BRL产品)完全培养液用于NB4、K562、U937、THP1、Jurkat、SHG44、ECV304、293、SMMC7721、MCF7、 T47D细胞的常规培养,SHI1细胞株培养于含15%胎牛血清的IMDM(Gibco/BRL)完全培养液中,HT29培养于含10%胎牛血清的Moca 5A(Gibco/BRL)完全培养液中。

    细胞转染  ①电穿孔转染目的基因:取对数生长期的NB4、U937、SHI1、THP1与Jurkat细胞1×107,将细胞悬液与20 μg质粒DNA(分别是pEGFP1、pEWP、pEWPA)混合均匀,在电容是950 μF条件下,设置优化后的相应电压,电击细胞。电穿孔转染48小时后加入适宜浓度的G418进行筛选。 ②脂质体转染目的基因:通过优化条件,分别将质粒pEGFP1、pEWP、pEWPA转染K562、MCF7、T47D、ECV304、SMMC7721、SHG44、HT29和293细胞。转染48小时后,1∶10传代并用合适剂量的G418筛选。

    绿色荧光蛋白平均荧光强度的检测

    收集2×106细胞,用1×PBS洗涤2次,加入完全培养液1 ml,在Coulter公司Epics XL型流式细胞仪上检测绿色荧光蛋白的平均荧光强度。上机检测前,再用1×PBS洗涤2次。激发波长为488 nm,释放波长为507 nm。

    EGFP基因转移效率的鉴定

    稳定转染pEWP的K562细胞的流式细胞仪分选  利用BDFACS AriaTM的分析软件在BDFACS AriaTM流式细胞仪上对K562/pEWP细胞进行分选,分别收集>2×106个不表达EGFP的阴性细胞和表达EGFP的阳性细胞,并利用试剂盒(GENTRA)抽提细胞DNA。

    转基因细胞株中转染目的基因的实时定量PCR检测  为进一步证实经G418筛选的转基因细胞中均稳定转染重组载体,评估EGFP基因转移效率,将流式细胞仪分选的EGFP阴性和阳性的K562细胞的DNA,利用SYBR Green I染料在MJ Research Opticon2TM荧光定量PCR仪上检测EGFP拷贝数,并以β2MG基因的拷贝数进行标化。优化的EGFP的检测体系为: 5×PCR 缓冲液 5.0 μl,250 mmol/L MgCl2 0.6 μl,10 mmol/L dNTPs 0.75 μl,20×SYBR Green I  1 μl,12.5 μmol/L引物各0.5 μl,5 U/μl HS Taq DNA聚合酶0.25 μl,DNA 1 μl (相当于50 ng的基因组DNA),反应总体积为25 μl。反应条件为: 94℃ 5分钟; 94℃ 45秒;63℃ 1分钟, 38个循环,分别于78℃和85℃时采集荧光信号。EGFP的引物序列:  E1: 5'CACCATGGTGAGCAAGGGCG3',E2: 5'CTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTC3' ,产物730 bp。基因组DNAβ2MG基因的序列: 正义链: 5'CAGGTTTACTCACGTCATCCAGC3' ,反义链: 5'TCACATGGTTCACACGGCAGGC3',产物 235 bp。

转基因细胞株中EGFP的表达水平实时定量PCR检测  为了评估转基因细胞中流式细胞仪检测的EGFP的平均荧光强度与转基因细胞中EGFP mRNA水平的相关性,利用实时定量PCR检测转基因细胞株中EGFP的表达水平。TRIZOL 一步法抽提转基因细胞株RNA并逆转录成cDNA链,参见文献[6]。EGFP引物序列和反应条件同DNA检测。cDNA内参照为βactin,引物序列:正义链: 5'ACACTGTGCCCATCTACGAGG3', 反义链: 5'AGTATGACGAGTCCGGCCCCT 3',产物621 bp。利用SYBR Green I染料同时检测EGFP和βactin的表达。 EGFPN=(EGFP的拷贝数/β2MG或βactin基因的拷贝数)×100%。β2MG或βactin表达水平低于104,则视本份标本质量不合格予以剔除。

    统计学处理

    采用SPSS 10.0统计软件,用均数±标准差(±SD)来表示转基因细胞株中EGFP的平均荧光强度(MFI)。应用一元方差分析比较启动子在不同肿瘤细胞中的调控作用。p<0.05有统计学差异。

    结    果

    WT1启动子和增强子的构建结构示意图

    经HindⅢ/PstⅠ双酶切后,WT1启动子片段与空载体pEGFP1连接,形成含有WT1启动子的重组质粒pEWP。经BamHⅠ酶切所得到的258bpWT1增强子的片段连接在pEWP的AflⅡ酶切位点,形成含有WT1启动子和增强子的重组质粒pEWPA(图1)。

    Figure 1. Construction of  pEGFP-1 inserted with WT1 promoter and enhancer.

    不同细胞株中WT1基因启动子的转录活性

    转染WT1启动子的ECV304细胞EGFP的平均荧光强度是空载体pEGFP1的16.54±2.45倍,显著高于白血病细胞株(p<0.05);其次是MCF7和SHG44细胞,分别为9.46±1.10和7.29±0.73,但与白血病细胞株K562细胞比较无统计学差异(p>0.05)。在人类白血病细胞株中,K562细胞EGFP的平均荧光强度最高,是空载体pEGFP1的2.93±0.27倍,明显高于Jurkat和SHI1细胞株(p<0.05)。后二者在所有转染的细胞中调控EGFP表达的活性最低,分别为0.74±0.03和0.84±0.09(图2和附表)。就WT1的表达水平而言,SHI1细胞株WT1基因的表达水平显著高于Jurkat细胞株,而ECV304细胞株WT1的表达水平也明显低于K562、SHI1等白血病细胞株,因此WT1基因启动子的转录活性与WT1基因的表达水平不相关,且没有造血组织特异性。

     WT1基因增强子对WT1基因启动子转录活性的影响

    转染pEWPA的HT29、SMMC7721、293、SHI1和K562细胞EGFP的平均荧光强度分别是空载体pEGFP1的10.14±0.23、3.52±0.36、3.42±0.48、3.40±0.29、5.95±0.14倍,高于转染pEWP的同一细胞株,因此具有促进WT1基因启动子转录活性增强的作用,其中HT29和SHI1细胞株中的增强作用最明显,分别使WT1启动子的转录活性增强了4.81倍和3.06倍,而K562细胞仅增强了1.03倍,SMMC7721和293细胞中增强作用不足1倍(图3和表1)。就HT29和SHI1两个细胞株而言,其WT1基因启动子的基础转录水平较K562低,但对WT1启动子的增强作用最明显。鉴于HT29为WT1基因低表达且非造血组织细胞,pEWPA能够显著增强其EGFP的平均荧光强度,因此WT1基因增强子对WT1启动子转录促进作用似乎与WT1基因的表达水平没有相关性,也不是造血组织所特有的。

    Figure 3. MFI of EGFP induced by pEWP and pEWPA  in different cell lines. 1:THP1; 2:HT-29; 4:MCF7; 5:SMMC7721; 7:293; 8:SHI1; 9:U937; 10:K562; 11:NB4;  12:Jurkat;  13:T47D.

    基因转染效率对WT1基因启动子转录活性的影响

    根据转基因细胞是否表达EGFP,利用流式细胞仪分选技术分选到2群细胞(图4),并利用实时定量PCR检测2群细胞中质粒整合到DNA的相对量分别为:阳性细胞群EGFPN为1.36,阴性细胞群中EGFPN为3.62。此结果说明EGFP阴性细胞群已经整合了质粒,且整合的量稍多于EGFP阳性的细胞,但是不表达EGFP。这进一步说明经G418筛选后的转基因细胞株能够稳定表达外源基因,消除了基因转染效率对外源基因表达的影响。K562细胞株中质粒转染的相对量( EGFPN): K562/pEGFP1为2.23±0.13,K562/pEWP为2.06±0.11,K562/pEWPA为2.17±0.17。经一元方差分析三者之间的整合水平无统计学差异。K562转基因细胞株中EGFP表达的相对量: K562/pEWP为4.35±0.40,K562/pEWPA为5.80±0.89。K562/pEWPA的EGFPN高于K562/pEWP,与流式细胞仪检测到K562/pEWPA 的EGFP的MFI高于K562/pEWP的结果相一致。

    讨    论

    我们利用EGFP做报告基因,通过比较稳定转染后EGFP的平均荧光强度来评估WT1基因启动子的转录活性,发现WT1基因启动子的转录活性与WT1基因是否表达没有相关性。在WT1基因表达水平较低的ECV304细胞中WT1基因启动子的转录活性最高,是空载体的16.54±2.45倍,而高表达WT1基因的K562细胞株EGFP平均荧光强度是空载体的2.93±0.27倍。在白血病细胞株WT1基因低表达的Jurkat细胞和WT1基因高表达的SHI1细胞中,转染WT1基因启动子后几乎都不能检测到EGFP的表达。这一结果说明WT1基因启动子调控EGFP表达的能力与细胞本身固有的WT1基因的表达水平不直接相关,提示WT1基因的特异性表达可能更多地取决于转录因子对WT1基因启动子的反式活化作用。

    我们将WT1基因第三内含子中存在的增强子连同WT1启动子转染白血病细胞株,发现在WT1低表达的造血细胞株U937、T细胞来源的白血病细胞株Jurkat及WT1基因高表达的非造血细胞株MCF7和多数WT1低表达的非造血细胞株中,WT1基因第三内含子中存在的增强子对WT1基因启动子的转录活性作用没有增强,而在WT1基因高表达的造血细胞株K562和SHI1细胞中具有增强WT1基因启动子的转录活性的作用。与Fraizer等[2]、Zhang等[3]及Hosen等[4]的研究相一致。但不同的结果是第三内含子中的WT1增强子对WT1基因高表达且具有向中性粒细胞分化潜能的NB4细胞和向单核细胞分化的THP1细胞并无增强作用,而对WT1基因低表达的非造血细胞株HT29细胞却具有显著增强作用。

    实验结果不尽相同的原因可能有: ①所使用的报告基因不同。据文献报道在较低质粒浓度时,作为报告基因,EGFP的灵敏度高于CAT,而在较高浓度时,CAT酶促反应具有放大作用[7];②转染场所与所使用的条件不同因而重组表达质粒在宿主细胞中的水平不同;③使用不同的细胞株;本研究所转染的13个细胞株的组织来源多样性,因此会产生不同的结果;④与载体构建中所连接的增强子有关。Hosen等[4]的研究中所使用的重组表达载体同时连接了2个增强子,分别位于WT1基因第3内含子和3'端,2个增强子之间可能通过某种作用方式使WT1基因启动子的表达具组织特异性。而本研究由于未能获得来自于3'端的增强子,故只对来自于WT1基因第3内含子中的增强子进行了详细的研究。通过分析转染更多的细胞株的结果,我们认为WT1基因第3内含子中存在的增强子对WT1基因启动子在WT1基因高表达的造血细胞中的转录调控的促进作用不具有普遍性,不同于Hosen等[4]的报道。鉴于对某些WT1基因低表达的非造血细胞,如HT29细胞的WT1基因启动子的转录活化作用也具有增强作用,我们认为WT1基因第三内含子中存在的增强子对WT1基因启动子的转录促进作用应为细胞特异性而非组织特异性。因此试图应用基于WT1基因调控元件来设计对白血病的基因治疗策略尚不成熟,需进一步仔细研究。

    本实验还发现,经合适剂量的G418筛选的细胞株,其EGFP不表达是细胞内在的因素导致基因静息的结果,而不是没有转染质粒所致。通过携带EGFP报告基因的WT1基因的启动子和增强子稳定转染细胞后,绝大多数细胞表现为不表达EGFP,提示稳定转染外源基因表达静息是一个极为常见的事件,它对研究基因调控序列的表达及应用转基因进行基因治疗都可能产生不利影响。

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