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lican8341的博客

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日志

 
 

启动子甲基化调控NK92MI细胞KIR3DL1基因表达  

2017-02-17 22:04:16|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的: 观察NK细胞系NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化模式及去甲基化和组蛋白乙酰化对基因表达的影响, 探讨KIR3DL1基因的表达调控机制。方法: 采用亚硫酸氢盐测序法检测NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区的甲基化状况, 应用甲基化抑制剂5氮胞苷和(或)组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂曲古抑菌素A处理NK92MI细胞以诱导CpG岛去甲基化和组蛋白乙酰化, 观察启动子区CpG岛甲基化和组蛋白乙酰化与KIR3DL1基因表达的关系。结果: NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子区高甲基化, CpG二核苷酸甲基化频率在70%~100%之间; 应用终浓度为2.5 μmol/L和5 μmol/L的5氮胞苷作用72 h可以诱导NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量分别增加66.6%和114.6%; 单用终浓度为50 nmol/L的曲古抑菌素A不能诱导NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量增加; 此外, 曲古抑菌素A和5氮胞苷联用与单用5氮胞苷相比也没有协同作用。结论: NK92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。

【关键词】  杀伤细胞抑制性受体 基因表达调控 DNA甲基 组蛋白乙酰化


  HLA半相合异基因造血干细胞移植具有广泛的临床应用前景, 但伴随的问题是移植物抗宿主病发生率高, 免疫重建缓慢, 感染机会增加, 如何克服这些问题是目前造血干细胞移植领域的研究热点。近年来一系列重要的临床研究发现, 在去除T细胞的HLA半相合异基因造血干细胞移植中, 杀伤细胞免疫球蛋白样受体(killer cell immnoglobulinlike receptor, KIR)表型不合(移植物抗宿主方向)是对预后有利的因素[1-4]。KIR基因家族是表达在人自然杀伤(nature killer, NK)细胞和部分T细胞表面的具有调节功能的细胞表面分子家族, 它通过与靶细胞表面相应的HLA I类分子结合, 传导激活或抑制信号, 调节NK细胞功能[5]。KIR基因在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达模式, 由此形成了多种多样的能够特异性的识别、 清除异常细胞的NK细胞群[6]。因此, 只有了解KIR基因表达调控机制, 才能进一步明确NK细胞的生物学特性, 才能使人为调控NK细胞活性为临床应用成为可能。但是, 目前关于KIR的表达调控机制尚不完全清楚。本研究旨在从表观遗传学的角度对KIR3DL1基因的表达调控机制进行深入研究。

  1  材料和方法

  1.1  材料  人NK细胞系NK92MI购自美国ATCC细胞库; 5氮胞苷(5azacytidine, Aza)、 曲古抑菌素A(trichostatin A, TSA)、 肌醇、 巯基乙醇、 叶酸均购自Sigma公司; 氢醌和亚硫酸氢钠由上海生化试剂公司生产; αMEM培养基、 TRIzol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司; 马血清、 胎牛血清购自Hyclone公司; DNA提取试剂盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit)、 MMLV逆转录酶、 dNTPs、 oligo(dT)18、 pGEMT easy载体、 T4 DNA连接酶、 感受态大肠杆菌JM109均购自Promega公司;  Taq酶购自TaKaRa公司; PCR产物回收试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit)购自Qiagen公司; PCR引物合成及测序均由北京奥科生物技术有限公司完成。

  1.2  方法

  1.2.1  细胞培养  NK92MI细胞用含2 mmol/L左旋谷氨酰胺、 1.5 g/L NaHCO3、 0.2 mmol/L肌醇、 0.1 mmol/L巯基乙醇、 0.02 mmol/L叶酸、 125 mL/L马血清、 125 mL/L胎牛血清的αMEM培养基, 于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养、 传代。

  1.2.2  总RNA及DNA的提取  采用TRIzol RNA提取试剂盒按说明书步骤提取细胞总RNA, 采用Wizard Genomic DNA Purification Kit按说明书步骤提取细胞基因组DNA, 紫外分光光度计定量。

  1.2.3  DNA的亚硫酸氢盐修饰  参照文献[7]的方法, 取1 μg经1 mL注射器抽吸剪切后的基因组DNA, 加入去离子水稀释至50 μL, 向其中加入3 mol/L NaOH 5 μL, 37℃孵育25 min使DNA解开双链; 然后加入新鲜配制的10 mmol/L氢醌30 μL及3 mol/L亚硫酸氢钠520 μL(其内已加3 mol/L NaOH 370 μL), 混匀后于50℃孵育16 h; 用QIAquick Gel Extraction Kit纯化修饰后的DNA, 加入3 mol/L NaOH 5 μL, 37℃孵育20 min终止硫化修饰, 最后经3倍体积的无水乙醇沉淀后溶于20 μL去离子水, 修饰后的DNA于-20℃贮存备用。

  1.2.4  PCR扩增及测序检测启动子甲基化状态  按照完全修饰后的KIR3DL1基因DNA序列设计特异性引物, 采用半巢式PCR扩增KIR3DL1基因启动子。第1轮PCR反应的上游引物: 5′GAAGAAGAGTTTGAATTTTAG3′, 下游引物: 5′CCATATCTTTACCTCCAAATC3′。以经亚硫酸氢钠修饰后的DNA为模板, 采用25μL的体系行PCR扩增, 体系包含2.5μL 10×PCR缓冲液、 1.5 mmol/L MgCl2、 200 μmol/L dNTPs、 上下游引物各10 pmol/L和1.25 U Taq酶。扩增条件: 95℃预变性10 min, 然后95℃ 90 s, 48℃ 1 min, 72℃ 1 min, 共34个循环, 循环结束后继续于72℃延伸10 min。将扩增产物经20倍稀释后取1 μL作为模板进行第2轮扩增, PCR条件同前,上 游引物: 5′GTTAGTATAGATTTTAGGTATTT3′, 下游引物序列同前, 扩增产物长度397 bp。PCR产物行15  g/L琼脂糖凝胶电泳, 将PCR产物切胶回收后用T4 DNA连接酶与pGEMT Easy载体相连,连接反应体系: PCR产物与pGEMT Easy载体比例为3∶1, 2×连接反应缓冲液 5 μL, T4 DNA连接酶1 μL, 用去离子水补至10 μL, 4℃孵育过夜。取5 μL连接反应产物转化感受态大肠杆菌JM109, 将PCR初步鉴定阳性的克隆送测序鉴定。

  1.2.5  甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂处理NK92MI细胞  实验前1 d将NK92MI细胞传代, 实验当天将细胞接种在 35 mm细胞培养皿中, 每个培养皿的细胞数为2×106个, 用2 mL完全培养基培养。实验孔加入终浓度依次为1 μmol/L、 2.5  μmol/L、 5 μmol/L的Aza, 或同时加入2.5 μmol/L的Aza和50 nmol/L的TSA, 或仅加入50 nmol/L的TSA, 对照孔加入等量PBS缓冲液, 细胞继续置于37℃、 50 mL/L CO2饱和湿度孵箱中培养。每隔24 h更换新鲜培养液及相同浓度的药物, 于处理72 h后收获细胞, 检测基因表达。每组实验重复3次。

  1.2.6  RTPCR检测KIR3DL1基因表达  在20 μL逆转录体系中加3 μg RNA, 42℃水浴1 h, 95℃ 5 min灭活逆转录酶后, 取1 μL逆转录反应液为模板行PCR扩增。根据文献[8]合成引物, KIR3DL1上游引物: 5′ACATCGTGGTCACAGGTCC3′, 下游引物: 5′ACAACTTTGGATCTGGGCTT3′, 产物长度为682 bp; 内参照βactin上游引物: 5′CGCGAGAAGATGACCCAGATC3′, 下游引物: 5′TTGCTGATCCACATCTGCTGG3′, 产物长度为734 bp。PCR体系同上。扩增条件: 94℃预变性5 min后, 94℃ 1 min, 61℃ 1 min, 72℃ 45 s, 共5个循环, 然后94℃ 30 s, 60℃ 45 s, 72℃ 45 s, 共30个循环, 循环结束后继续于72℃延伸10 min。PCR产物行15  g/L琼脂糖凝胶电泳, 紫外凝胶成像仪扫描分析, 以KIR3DL1/βactin光密度比值作为KIR3DL1 mRNA水平相对值。

  1.2.7  统计学处理  数据以x±s表示, 采用SPSS10.0统计软件包行t检验, 检验水准以P<0.05认为有统计学意义。

  2  结果

  2.1  NK92MI细胞中KIR3DL1启动子区甲基化模式  CpG二核苷酸在KIR基因转录起始区域密度增加, 其出现率(观测值与期望值的比率)≥0.6, 符合CpG岛的定义[9], 因此, 本研究将KIR3DL1基因自转录起始位点上游-270 bp至下游+69 bp之间的这段长339 bp的序列定义为CpG岛, 为便于分析说明, 将这段序列内的全部19个CpG二核苷酸位点以转录起始位点编号, 上游为“-”, 下游为“+”。NK92MI细胞基因组DNA经亚硫酸氢盐修饰后, 采用PCR扩增KIR3DL1基因启动子序列, 将扩增产物连接到T载体, 转化感受态大肠杆菌, PCR初步鉴定阳性重组子, 随机挑取10个克隆行初步PCR鉴定, 均可扩增出与预期大小相一致的目的片段(图1)。阳性克隆进一步测序, 结果与GenBank数据库中KIR3DL1基因启动子序列(基因号NM_013289)比对, 除第1、 4、 5号克隆序列错误外, 得到7条正确的序列。亚硫酸氢盐修饰可以使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶保持不变, 以第10号克隆测序结果为例, 可见全部19个CpG二核苷酸位点由于被甲基化, CpG二核苷酸中的胞嘧啶保持不变, 其他部位的“C”全部发生改变(图2)。综合分析所得7条正确序列测序结果, NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子CpG二核苷酸位点甲基化频率在70%~100%之间, 因此, KIR3DL1基因启动子处于高度甲基化状态(图3)。

  图1PCR方法鉴定含KIR3DL1启动子pGEMT easy载体的克隆(略)

  Fig 1  Identification of clones containing KIR3DL1 promoterpGEMT easy vector by PCR amplification

  M: DNA marker; 1-10: PCR products of clone 1 to 10.

  图2  经硫化修饰后的KIR3DL1启动子部分测序结果(略)

  Fig 2  Partial result of DNA sequencing of bisulfiteconverted KIR3DL1 promoter

  图3  NK92MI细胞系中KIR3DL1启动子各CpG位点的甲基化频率(略)

  Fig 3  Methylation frequency at individual CpG positions of KIR3DL1 promoter in NK92MI cell line

2.2  去甲基化诱导NK92MI细胞KIR3DL1表达增加  为进一步分析KIR3DL1基因启动子甲基化与基因表达的关系, 采用不同浓度的去甲基化药物Aza处理NK92MI细胞, 结果显示, 终浓度为1 μmol/L的Aza作用72 h, NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比无明显增加(t=0.632, P=0.562), 而2.5 μmol/L和5 μmol/L的Aza可以使KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比分别增加66.6%和114.6%(统计分析结果分别为: t=3.411, P=0.027; t=6.454, P=0.003), 说明去甲基化药物Aza可以诱导NK92MI细胞中KIR3DL1表达, 随药物浓度增加, 这一诱导作用逐渐增强(图4A); 单用50 nmol/L的TSA处理NK92MI细胞72 h, KIR3DL1 mRNA表达量与对照组相比无统计学意义(t=0.203, P=0.852), 将50 nmol/L的TSA与2.5 μmol/L Aza联用处理NK92MI细胞72 h, KIR3DL1 mRNA表达量与单用Aza组相比也无统计学意义(t=1.840, P=0.140), 说明单用TSA不能诱导KIR3DL1表达, 其与Aza联用后也没有协同作用(图4B)。

  图4  RTPCR方法检测经5氮胞苷和曲古抑菌素A处理的NK92MI细胞中KIR3DL1 mRNA表达(略)

  Fig 4  Detection of KIR3DL1 mRNA levels in 5azacytidine and trichostatin Atreated NK92MI cells by RTPCR

  A: NK92MI cells were treated with different final concentrations of 5azacytidine (1 μmol/L, 2.5 μmol/L and 5 μmol/L) for 72 h; B: NK92MI cells were treated with 2.5 μmol/L of 5azacytidine and (or) 50 nmol/L of trichostatin A for 72 h. aP<0.05 vs   control group.

  3  讨论
    
  KIR基因家族位于人染色体19q13.4, 目前发现有17个成员。KIR基因家族的特点是各成员在NK细胞表面呈随机性、 多样性的表达, 每个NK细胞只表达KIR基因家族部分成员, 一种KIR分子的表达不依赖于其他KIR分子, 从而形成了表达多种多样KIR分子的NK细胞群[5]。KIR基因的这一特有的表达模式对NK细胞特异性识别和清除异常细胞非常重要。在异基因造血干细胞移植中由于供受者之间KIR不相容引发的异源反应性NK细胞活性有利于增强移植物抗白血病作用、 抑制移植物被排斥和移植物抗宿主病、 促进造血干细胞植入, 延长患者生存期, 因此, 明确KIR表达调控机制, 调节NK细胞活性, 对改善造血干细胞移植预后具有重要临床意义, KIR基因表达调控机制已成为近年来的研究热点[10]。KIR3DL1基因与KIR家族其他成员的5′侧翼区序列同源性高达91.1%~99.6%, 在NK细胞表面呈多样性表达[11]。本研究组的前期实验证实KIR3DL1基因启动子在没有内源性KIR3DL1基因表达的K562细胞中具有活性(结果未显示); Stewart等[12]的研究也证实, KIR3DL1基因启动子不仅在有KIR3DL1基因表达的NK细胞系YTIndy中有活性, 并且在没有KIR3DL1基因表达的T细胞系Jurkat中也具有活性。可见KIR3DL1基因转录激活所需的反式作用因子在不同细胞系中广泛分布, 提示表观遗传机制可能在调控KIR3DL1基因表达中发挥重要作用。为此, 本研究首先采用亚硫酸氢盐测序法对NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子甲基化状态进行了检测, 证实KIR3DL1基因启动子存在高甲基化, 然后用去甲基化药物处理NK92MI细胞, 研究启动子甲基化与KIR3DL1基因表达的关系, 以确定KIR3DL1基因的表达是否受甲基化调控。
    
  大量研究已证实DNA甲基化可以调控基因表达[13], 启动子甲基化, 基因转录活性被抑制; 去甲基化, 这一抑制作用被取消。DNA甲基化介导转录抑制的机制可能包括以下三方面: 其一, DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位点相结合, 抑制基因转录; 其二,  通过在甲基化DNA上结合特异的转录阻遏物(如甲基胞嘧啶结合蛋白1, 2), 这种蛋白质可以和转录因子竞争性地与甲基化DNA的结合位点结合, 抑制基因转录; 其三, 甲基化改变了蛋白质与DNA的相互作用, 导致染色质结构的改变,抑制基因转录。Aza是一种常用的甲基化抑制剂,  它通过与DNA甲基化酶共价结合, 降低其生物活性,从而逆转DNA甲基化。本研究证实Aza能够诱导NK92MI细胞KIR3DL1基因表达增加, 由此可以推断KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。
    
  组蛋白乙酰化是表观遗传调控的另外一个重要方面[14], 组蛋白乙酰化由乙酰基转移酶催化完成, 此时染色质呈疏松状态, 有利于基因的表达; 相反, 组蛋白去乙酰化由去乙酰基转移酶催化完成, 此时染色质呈压缩状态, 不利于基因的表达。组蛋白去乙酰化转移酶抑制剂TSA通过提高组蛋白乙酰化水平, 活化基因转录。但本研究应用TSA处理NK92MI细胞, 未见KIR3DL1基因表达增加, 也没有观察到其与Aza的协同作用; 本研究的前期结果显示, 即使用300 nmol/L的TSA也不能明显增加KIR3DL1基因转录(结果未显示); Santourlidis等[15]的研究也发现, 用25 nmol/L的TSA处理NKL细胞系不能诱导KIR3DL1基因转录增加。由此推测组蛋白乙酰化可能在KIR3DL1基因表达调控中作用不大。
    
  综上所述, 通过检测NK92MI细胞KIR3DL1基因启动子区甲基化模式, 证实NK92MI细胞中KIR3DL1基因启动子存在高甲基化, 去甲基化处理能够诱导NK92MI细胞表达KIR3DL1基因, 因此, NK92MI细胞中KIR3DL1基因表达受启动子甲基化调控。

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