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lican8341的博客

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日志

 
 

人转录因子USF基因在大肠杆菌中的表达、纯化及在FAK启动子中的结合研究  

2017-02-17 22:08:05|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

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【摘要】  目的:在大肠杆菌中表达人源转录因子USF(upstream stimulatory factor)并进行分离纯化,进一步分析其在FAK(focal adhesion kinase)启动子中的DNA结合能力。方法:将人源USF cDNA克隆到表达质粒pET28a载体,然后将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达带His6Tag的融合蛋白HisUSF,通过镍柱亲和层析纯化,SDSPAGE分析鉴定。EMSA分析纯化后的蛋白与FAK启动子的DNA 结合情况。结果: HisUSF在大肠杆菌中获得高效表达,镍柱亲和层析纯化得到了高纯度的蛋白,并能够结合到FAK的启动子上。结论:获得高效表达的高纯度HisUSF融合蛋白,为USF对其靶基因的结合与转录调控的进一步研究奠定了基础。

【关键词】  USF基因 粘着斑激酶 蛋白表达 转录因子

    许多重要的细胞活动是由bHLH类型(basic helixloophelix)的转录因子所调控的,USF(upstream stimulatory factor)就是这种类型的重要的转录因子。它含有helixloophelix结构域,以二聚化的形式结合到靶基因的调控区,调节基因的转录[1]。它在靶基因上结合位点含有CACGTG Ebox结构。

    USF最初是作为腺病毒晚期启动子的反式激活因子而被发现的[1],后来的研究证明USF在组织中的分布很广泛[23],许多的细胞基因也受到其调控[48]。受其调控的靶基因多是和细胞外基质、细胞生长、细胞增殖等相关的基因[47]及对压力刺激反应的基因[8]。USF在一些肿瘤中的表达水平明显异常[9]。

    为了研究USF在FAK(focal adhesion kinase)基因调控中的作用,我们首先用原核表达系统获得USF蛋白,并初步分析其在FAK基因启动子中的结合能力。

    1  材料与方法

    1.1  材料

    pET28a、大肠杆菌Top10、BL21(DE3)由本实验室保存。含有人USF cDNA的质粒pRK5huUSF由 Philippe Pognonec 赠送(Institute of Signaling,Developmental Biology and Cancer Research, Parc Valrose, 06108 Nice cedex 2, France)。PCR试剂、限制性内切酶、T4连接酶、T4多聚核苷酸激酶等购自TaKaRa公司,IPTG购自华美生物公司,3S柱离心式琼脂糖DNA小量快速纯化试剂盒购自申能博彩生物科技有限公司,NiIDA填料购自Phamarcia公司,ProbeQuantTMG50微型离心柱购自安玛西亚,32PdATP购自北京福瑞公司。

    1.2  方法

    1.2.1  重组质粒的克隆  首先,按照USF编码序列设计引物,USF cDNA 扩增引物如下:USF上游引物(含EcoRI位点)5′CCG GAATTC ATG AAGGGGCAGCAGAAAACAGC3′,USF下游引物(含HindⅢ)5′GTCCC AAGCTT TTAGTTGCTGTCATTCTTGATGAC3′,扩增的cDNA 大小为933 bp ,USF cDNA编码310个氨基酸。PCR产物纯化回收后,经EcoRI和HindⅢ双酶切,用T4连接酶连接到同样酶切回收的pET28a载体中,转化大肠杆菌Top10,卡那霉素抗性板筛选阳性克隆,经酶切鉴定后送上海英俊(Invitrogen)公司测序。

    1.2.2  融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达和纯化  将重组质粒pET28aUSF转化BL21(DE3)大肠杆菌,挑单克隆于1 L有卡那霉素的新鲜LB液体培养基中37 ℃摇菌培养,当其A260约达到0.8时,加入终浓度为1 mmol·L-1 IPTG,诱导3 5 h,收获菌体,进行SDSPAGE分析。将表达菌体重悬于 60 ml Buffer B(50 mmol·L-1 Na3PO4,300 mmol·L-1 NaCl,10 mmol·L-1 imidazole,pH 8.0),超声破碎,离心取上清,NiIDA亲和层析柱由Buffer B 平衡过后上样,再用Buffer C(50 mmol·L-1 Na3PO4 ,300  mmol·L-1 NaCl,50 mmol·L-1 imidazole,pH 8.0)洗去杂蛋白,最后通过Buffer D(50 mmol·L-1 Na3PO4,300 mmol·L-1 NaCl,250 mmol·L-1 imidazole,pH 8.0)洗脱,收集目的蛋白洗脱峰。

    1.2.3  细胞核抽提  根据文献[10 ]抽提3T3细胞核蛋白,PBS洗涤3T3细胞2次,然后用细胞刮刮取细胞,重悬于Buffer 1(10 mmol·L-1 HEPES,pH 7.9,10  mmol·L-1 KCl,1.5 mmol·L-1 MgCl2,0.1 mmol·L-1EGTA,0.5 mmol·L-1DTT,0.5 mmol·L-1 PMSF,1 μg·ml-1 aprotinin,1μg·ml-1 leupeptin),冰上放置15 min,离心12 000 r·min-1 15 min,收集细胞核,重悬于Buffer 2(10 mmol·L-1HEPES,pH 7.9,0.4 mol·L-1NaCl,1.5 mmol·L-1 MgCl2,0.1 mmol·L-1 EGTA,0.5 mmol·L-1 DTT,0.5 mmol·L-1 PMSF,1 μg·ml-1 aprotinin,1 μg·ml-1 leupeptin,5%甘油)冰上放置30 min,离心12 000 r·min-1 15 min,吸取上清,即为核蛋白部分,采用考染法进行蛋白定量。

    1.2.4  EMSA探针的标记和纯化  寡核苷酸片段P1为5′TTCTGACCTCCACGTGCACCAGGCAT3′,该序列位于FAK启动子上游,标准结合序列为5′CAC CCGGTCACGTGGCCTACACC3′(Santa Cruz公司提供),其中粗体加框部分为USF转录因子识别的核心序列Ebox; P1的突变序列mP1是把USF转录因子识别的核心序列Ebox突变掉,mP1的序列为5′TTCT GACCTCCAATTGCACCAGGCAT3′,其中粗体加框部分AT代替了P1中的CG。首先在上海申能博彩公司合成P1、mP1、标准序列的寡核苷酸及互补序列,然后用32PdATP和T4多聚核苷酸激酶标记寡核苷酸探针P1及mP1,37 ℃标记45 min,加热至65 ℃并保温5 min,然后补充30 μl TE缓冲液至总体积50 μl,使用ProbeQuantTMG50微型离心柱对标记的探针进行纯化,取1 μl样品用放射性测量仪测定比活。

    1.2.5  EMSA  根据文献报道[10],在500 μl Eppendorf管中进行探针和蛋白的结合反应,10 μg的核抽提蛋白加入Buffer 3[50  mmol·L-1 TrisHCl,pH 7.9,12.5  mmol·L-1 MgCl2,1 mmol·L-1 EDTA,1 mmol·L-1 DTT,20%甘油,0.5 mmol·L-1 PMSF,2 μg poly(dIdC)],20 000 cpm 标记探针及100倍非标记竞争探针。30 ℃温育1 h之后将样品直接加载到已经预电泳2 h的4.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶,胶厚度为1 mm,以0.5×TBE/1%甘油为电泳缓冲液,100 V电泳2 3 h,直到溴酚蓝条带迁移至泳道2/3处,在20%甲醇/10%乙酸固定液中固定15 min之后将凝胶转移到双层滤纸上,保鲜膜包好后对储磷屏曝光过夜,使用Cyclone的phosphor imager获取并分析磷屏捕捉的信息。

    2  结    果

    2.1  构建表达质粒pET28aUSF

    以质粒pRK5huUSF为模板,扩增USF 的cDNA,PCR上下游引物的两端分别加有限制性内切酶EcoRI和HindⅢ的识别位点。PCR扩增产物如图1所示。然后插入到pET28 a,构建的重组pET28aUSF质粒如图2A所示,酶切鉴定结果如图2B所示。最后经测序证明完全正确。

2.2  融合蛋白HisUSF的诱导表达与分离纯化

    经SDSPAGE分析表明,重组蛋白在大肠杆菌中实现了高效表达,其中主要为可溶性形式,重组蛋白的相对分子质量约为47 000,与理论值相符。利用USF蛋白N端融合有HisTag,融合蛋白用镍柱亲和层析一步纯化获得目的蛋白,纯化过程简单、高效。一步亲和层析纯化后的样品纯度可达到93%左右,见图3。

    2.3  融合蛋白HisUSF与FAK启动子上Ebox的结合实验    一个预测的Ebox顺式元件在FAK启动子上,我们命名为P1,其核心序列为典型的CACGTG Ebox,位于转录起始位点上游的-1 019 bp处(图4A),转录起始位点由FAK mRNA转录本DQ478406用RACE方法确定。在EMSA实验中用3T3细胞核抽提与P1形成了DNA蛋白复合物,并可被特异的标准序列竞争,用纯化的蛋白也可以形成强烈的结合条带,而把核心序列突变后的探针则不形成结合条带(图4B)。

    3  讨    论

    FAK是一种相对分子质量为125 000的非受体酪氨酸激酶,是细胞外基质的下游信号激酶,主要参与细胞和ECM的局部粘附,是整合素介导的细胞外基质分子向细胞内传递的重要信号蛋白[1112],所以命名为着粘着斑激酶(focal adhesion kinase)。

    FAK基因不仅在进化中非常保守[1315],FAK蛋白的高表达在肿瘤发生过程中也扮演了非常重要的角色,它在许多肿瘤中的表达都明显增高,而且与恶性程度相关[1618]。 因此,认识FAK的表达调控机制不仅有助于理解其进化上的演变,也可以了解癌的发生机制,提供潜在的治疗靶点。

    本实验中,我们利用大肠杆菌原核表达系统高效表达了转录因子USF,并用一步法快速纯化出目的蛋白。 EMSA证实纯化出的蛋白及3T3细胞的核抽提都能够有效结合到FAK启动子的上游Ebox 位点,而把Ebox 位点突变后,则失去了结合能力。说明Ebox位点确实是一个潜在的顺式调控序列,更进一步的研究还需要证实USF对FAK启动子的反式激活作用,以及USF对内源性FAK表达的影响等。总之,我们表达纯化出HisUSF蛋白,为其在靶基因的调控研究奠定了初步的基础。

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