注册 登录  
 加关注
   显示下一条  |  关闭
温馨提示!由于新浪微博认证机制调整,您的新浪微博帐号绑定已过期,请重新绑定!立即重新绑定新浪微博》  |  关闭

lican8341的博客

霜剑如梦倚残翼,泊影难觅几何时!

 
 
 

日志

 
 

CTL前体频率对CD8+ CTL应答类型的影响  

2017-02-17 21:40:43|  分类: 抬头望见北斗星— |  标签: |举报 |字号 订阅

  下载LOFTER 我的照片书  |

【摘要】  目的: 探讨CTL前体的频率对CTL应答类型的影响。方法: 用重组鼠IL4和GMCSF诱导小鼠骨髓来源DC发育成熟, 卵清蛋白Ⅰ(OVAⅠ)多肽激活DC, 流式细胞术(FCM)分析DCOVA表型; 用OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA接种Iab-/- C57BL/6小鼠, FCM检测小鼠体内OVA特异性CTL及特异性CTL对OVA特异性脾细胞的体内细胞毒作用, 并观察DCOVA免疫后小鼠肺肿瘤的生长情况。结果: 经OVAⅠ多肽刺激后, DC表面有高水平CD11c、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb分子及pMHCⅠ复合体表达; 注射不同剂量(0×106、 0.25×106、 0.5×106、 1×106、 5×106)OVA特异性CD8+ T细胞后, 小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比分别为0.01%、 1.31%±0.21%、 2.34%±0.17%、 3.11%±0.25%、 4.23%±0.32%, 注射CD8+ T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高(P<0.05), 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血OVA特异CTL为2.45%±0.22%; 各剂量组CFSElow细胞数不变, CFSEhigh细胞随着CD8+ T细胞数的增加而逐渐减少, 小鼠肺肿瘤数随接种CD8+ T细胞数的增加而减少(P<0.05)。结论: 增加CTL前体频率可使CTL应答类型由CD4+ T细胞依赖型转变为CD4+ T细胞非依赖型。

【关键词】  CTL前体 频率 CTL应答 CD4+ T细胞

  CD8+ T细胞通过细胞膜表面的T细胞(TCR)识别特异性抗原而活化、 增殖、 分化为细胞毒性T细胞(CTL), 对靶细胞发挥特异性杀伤作用。正常情况下, 细胞毒性T细胞的活化依赖于CD4+ T细胞的辅助。CD4+辅助性T细胞(Th)接受抗原提呈细胞(APC)提呈的抗原活化以后可分泌细胞因子和表达共刺激分子, 辅助CD8+ T细胞的活化。然而有研究报道, 许多病毒在缺乏Th细胞的条件下仍可刺激机体产生特异性的CTL免疫[1,  2]。表明CD8+ T细胞可通过某种信号方式活化其自身, 而这种信号的加强要求足够数量的CD8+ T细胞。我们通过给CD4+ Th细胞缺陷小鼠注射卵清蛋白(ovalbumin, OVA)特异的CD8+ T细胞, 探讨CTL前体频率对CTL免疫应答的Th细胞依赖性的影响。

  1  材料和方法

  1.1  材料  OVAⅠ多肽为SIINFEKL公司产品。FITC标记的抗鼠CD11c、 CD40、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb和H2 Kb/OVAⅠ复合物(pMHCⅠ)抗体为Pharmingen公司产品。PE标记的抗鼠H2 Kb/ OVA257264抗体购自Beckman Coulter公司。重组鼠IL4和GMCSF为R&D公司产品。荧光染料CFSE为Molecular Probes公司产品。MO4为转OVA基因的黑色素瘤细胞, 具有高度肺转移特性, 由本室保存。OVA特异的TCR转基因OTⅠ小鼠和野生型C57BL/6小鼠(B6; CD45.2+)、 Iab缺陷型(Iab-/-)C57BL/6小鼠(雌性, 体质量23~30 g, 6~8周龄)由Jackson实验室引进。

  1.2  方法

  1.2.1  小鼠骨髓来源DC的培养及激活  CO2窒息法处死小鼠, 无菌条件下取小鼠股骨、 胫骨,  PBS冲洗骨髓至髓腔变白, 收集冲洗液,  1 500 g离心5 min,  收集细胞用PBS洗2次。TrisNH4Cl裂解红细胞,  用含20 μg/L GMCSF、 1  μg/L IL4的DMEM培养基重悬细胞至2×109/L, 按每孔4 mL加入24孔板,  置37℃、 50 mL/L CO2培养。第3天更换培养液,轻轻晃动培养板, 弃去上清, 补入含细胞因子的DMEM完全培养液。第6天细胞换液,  用吸管轻轻冲洗,  收集上清,  1 500 g离心5 min,  用含20 μg/L  GMCSF、 1   μg/L  IL4 和15  μg/L TNF的DMEM培养液重悬细胞, 继续培养24 h后收集细胞, 换无血清的AIMV培养液, 加入OVAⅠ多肽(0.3 g/L),  置37℃、 50 mL/L  CO2培养过夜, 次日收集细胞进行表型鉴定。

  1.2.2  OVA特异性CD8+ T细胞的分离  CO2窒息法处死OTⅠ小鼠, 无菌分离脾脏, 置于盛有适量无菌PBS的小平皿中, 经200目钢网研磨, 制成单个细胞悬液。PBS洗2次。用 RPMI1640培养液重悬细胞, 加入尼龙毛柱中, 常规培养1 h, 收集流出的T淋巴细胞, PBS洗2次, 然后将细胞悬浮于PBS中, 采用免疫磁珠结合的抗CD4单克隆抗体(mAb)阴性选择法(按说明书进行操作)去除CD4+ T细胞,  富集CD8+ T细胞。

  1.2.3  DC表型分析  收集经OVAⅠ刺激的骨髓细胞, 用PBS悬浮为1×109/L, 加入流式细胞术(FCM)测定管, 每管1 mL, PBS洗2次, 离心去上清后加入PBS 100  μL, 分别加入FITC标记的抗鼠CD11c、 CD40、 CD80、 CD54、 Iab、 Kb和pMHCⅠ抗体1  μL。混匀后于4℃避光孵育30 min,  PBS 洗2 次,  FCM分析。

  1.2.4  CD8+ T细胞接种小鼠  OVA特异CD8+ T细胞以不同剂量(0×106、 0.25×106、 0.5×106、 1×106、 5×106)经尾静脉接种Iab-/-C57BL/6小鼠, 每个剂量组10只, 野生型C57BL/6小鼠作为对照未接种CD8+ T细胞, 第2天野生型及Iab-/-C57BL/6小鼠均尾静脉接种DCOVA(0.5×106/只), 第7天采血检测OVA特异性CTL, 次日尾静脉注射MO4细胞(1×106/只), 每个剂量组注射5只小鼠(另外5只用于体内细胞毒实验), 21 d后杀死小鼠肉眼观察小鼠肺肿瘤生长情况, 计数肿瘤数目。

  1.2.5  小鼠体内OVA特异CTL的检测  小鼠断尾取血50 μL, 加入10  μL PE标记的H2 Kb/OVA257264试剂, 混匀, 室温避光孵育30 min,  加入1 μL FITC标记的抗CD8 mAb, 室温避光孵育30 min, 再加入红细胞裂解液, 室温避光作用30 min后用含5 g/L BSA的PBS洗2次, FCM分析。

  1.2.6  体内细胞毒实验  CO2窒息法处死C57BL/6小鼠, 无菌取脾脏, 制备脾细胞悬液, 用无血清RPMI1640培养液调整细胞密度为5×109/L, 加入15 mL离心管, 每管10 mL, 分别加入CFSE使其终浓度为0.6  μmol/L和3.0 μmol/L, 制备CFSElow细胞(0.6  μmol/L)和CFSEhigh细胞(3.0  μmol/L), CFSEhigh细胞加入OVAI多肽, 置37℃、 50 mL/L CO2孵育1 h。1 500  g离心5 min,  PBS洗2次,  再将CFSElow细胞和CFSEhigh细胞按15∶19比例混合, 注射上述经OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫的小鼠(1×106/只), 每个剂量组5只, 16 h 后制备脾细胞悬液FCM分析。

  1.2.7  统计学处理  实验数据用x±s表示, 应用SPSS11.5统计分析软件进行方差分析。P<0.05为有统计学意义。

  2  结果

  2.1  活化DC表面膜分子的表达  小鼠骨髓细胞培养7~8 d后, 镜下可见细胞具有典型的DC形态,  经细胞计数和FCM鉴定其纯度达85%以上, 细胞表面CD11c表达率为90.5%, CD80表达率为79.8%, CD54表达率为81.2%,  Iab表达率为71.3%,  Kb表达率为83.1%, pMHCⅠ复合体表达率为69.6%(图1)。表明细胞为活化DC(即DCOVA)。

  图1  OVAⅠ多肽激活的DC表面分子的分析(略)

  2.2  小鼠体内OVA特异性CTL的检测  不同浓度CD8+ T细胞接种Iab-/-小鼠, 第2天接种DCOVA, DCOVA免疫后第6天采血检测OVA特异CTL, FCM分析结果显示, 注射不同浓度CD8+ T细胞后, 小鼠外周血OVA特异CTL(即H2 Kb/OVA257264、 CD8双阳性细胞)占CD8+ T细胞的百分比分别为0.01%、 1.31%±0.21%、 2.34%±0.17%、 3.11%±0.25%、 4.23%±0.32%, 注射CD8+ T细胞组OVA特异CTL百分比均较对照组明显增高(P<0.05)。未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠外周血OVA特异CTL百分比为2.45%±0.22%(图2)。

  图2  CTL前体频率对OVA特异性CTL的影响(略)

  2.3  体内细胞毒实验  OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫后第6 天小鼠尾静脉注射CFSElow和CFSEhigh混合细胞, 16 h后制备脾细胞悬液, 经FCM分析, 结果显示, 各剂量组CFSElow细胞不变, 相对数均为100, 未接种CD8+ T细胞的Iab-/-小鼠CFSEhigh细胞相对数为99,  随着注射CD8+ T细胞数的增加, CFSEhigh细胞逐渐减少, 表明小鼠体内产生了OVA特异性免疫, 对照组C57BL/6小鼠的CFSEhigh细胞为43(图3)。

 图3  OVA特异性CTL的体内细胞毒作用(略)

  2.4  特异性CTL对小鼠肺肿瘤生长的影响  MO4细胞尾静脉注射OVA特异CD8+ T细胞和DCOVA免疫的小鼠, 21 d后杀死小鼠, 于小鼠肺脏表面可见大小不等的褐色肿瘤生长, 随着注射的CD8+ T细胞数的增加, 肿瘤数减少(P<0.05), 注射1×106、 5×106 CD8+  T细胞组未见肿瘤生长(图4、  5)。

  图4  注射CD8+ T细胞对Iab-/-小鼠肺肿瘤生长的影响(略)

  A:  未接种CD8+ T细胞; B: 注射1×106 CD8+ T细胞.

  3  讨论
    
  CD8+ T细胞在抗肿瘤及抗细胞内感染免疫中发挥重要的作用。通常情况下,  CD8+ T细胞的活化需要Th细胞的辅助[3, 4]。然而许多病毒可刺激CTL免疫而不需Th细胞的辅助, 表明CD8+ T细胞可通过某种信号方式活化其自身, 而这种信号的加强要求足够数量的CD8+ T细胞。为了探讨CD8+ T细胞频率对CTL应答类型的影响, 我们从OTⅠ小鼠分离OVA特异的CD8+ T细胞, 以不同剂量注射Iab-/-小鼠, 同时注射相同剂量DCOVA,  5 d后检测小鼠体内OVA特异性CTL。OTⅠ小鼠为OVA特异性TCR Vα2Vβ5转基因的C57BL/6小鼠[5], 将其脾细胞过尼龙毛柱去除B淋巴细胞, 再采用免疫磁珠结合的抗CD4  mAb阴性选择法去除CD4+ T细胞, 可获得纯度大于98%的OVA特异的CD8+/Vα2Vβ5 T淋巴细胞。Iab-/-小鼠由于其MHCⅡ类分子Iab缺陷导致体内缺乏能辅助OVA特异性CD8+ T细胞活化的CD4+ T细胞[6]。

  图5  OVA特异性CTL对Iab-/-小鼠肺肿瘤生长的影响(略)

  本研究结果显示, 未注射T细胞的Iab-/-小鼠外周血OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比为0.01%, 注射不同浓度 OVA特异CD8+ T细胞后, OVA特异CTL占CD8+ T细胞的百分比分别为1.31%、 2.34%、 3.11%、 4.23%; 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠OVA特异CTL百分比为2.45%。提示在Th细胞缺陷的Iab-/-小鼠由于体内OVA特异CTL前体频率极低, 虽有DC的抗原提呈作用亦不能刺激产生特异CTL应答。相反, 未接种CD8+ T细胞的野生型C57BL/6小鼠由于体内有OVA特异Th细胞存在, 给予DCOVA刺激后可诱导产生特异CTL免疫。给Iab-/-小鼠注射OVA特异CD8+ T细胞后, 在缺乏特异性Th细胞的条件下有效诱导了特异性CTL应答。表明增加CTL前体频率可使CTL应答类型由Th细胞依赖型转变为Th细胞非依赖型。为了验证这些CTL的细胞毒活性, 我们给小鼠注射CSFE标记[7]的CFSElow脾细胞和OVA特异CFSEhigh脾细胞, 通过FCM分析特异性CTL免疫对OVA致敏的CFSEhigh细胞的杀伤作用。结果显示, 随着注射的CD8+ T细胞数目的增加, 小鼠体内CFSEhigh细胞逐渐减少。进一步通过肿瘤攻击动物实验证实, 随着注射的CD8+ T细胞数的增加, 小鼠肺肿瘤生成减少, 表明小鼠体内产生了OVA特异性CTL免疫。本实验证实了增加CTL前体频率可使CTL应答类型由Th细胞依赖型转变为Th细胞非依赖型, CD8+ T细胞通过什么方式活化其自身有待进一步研究。

  评论这张
 
阅读(7)| 评论(0)
推荐 转载

历史上的今天

在LOFTER的更多文章

评论

<#--最新日志,群博日志--> <#--推荐日志--> <#--引用记录--> <#--博主推荐--> <#--随机阅读--> <#--首页推荐--> <#--历史上的今天--> <#--被推荐日志--> <#--上一篇,下一篇--> <#-- 热度 --> <#-- 网易新闻广告 --> <#--右边模块结构--> <#--评论模块结构--> <#--引用模块结构--> <#--博主发起的投票-->
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

页脚

网易公司版权所有 ©1997-2018